研究背景卵巢癌(Ovarian Cancer OC)在围绝经期妇女中很常见,发病原因不明,缺乏早期临床症状。在所有妇科肿瘤中,卵巢癌的发病率排名位居前列,虽然低于宫颈癌和子宫内膜癌,但其死亡率却远高于前两者。由于卵巢的位置在盆腔深处,体积与其他器官相比更小,不易观察,缺乏典型的识别特征,因此很难在早期的检查和诊治中被发现确诊,因此卵巢癌的发病过程较为隐秘,四分之三的的卵巢癌患者在确诊时已经进入晚期阶段。在我们国家,虽然诊治水平已经提高,但是卵巢癌每年的发病率和死亡率仍然居高不下,卵巢癌患者的五年生存率约为42%,并且治疗后超过半数的患者会在两年内再次发病。现阶段针对卵巢癌的治疗方法主要是手术和铂类化疗,尽管手术技能不断提高,化疗方案不断的完善改进,但卵巢癌患者的五年生存率并未较之前有显著的改善。七氟醚是一种挥发性麻醉剂,通常用于外科手术,包括肿瘤切除。与静脉注射麻醉剂相比,具有恢复快速和风险可预测等优点,七氟醚在临床上用于吸入麻醉已有20多年的历史,并已在众多研究中得到测试,安全性和有效性已经得到了很好的证实。体外生长的证据表明,七氟醚可能在肿瘤的发展中发挥作用,在不同的肿瘤中,甚至同种肿瘤的不同类型细胞中,七氟醚表现出了不同的影响效果。鉴于卵巢癌在女性疾病中的巨大危害,以及在卵巢癌手术治疗中,麻醉药七氟醚的广泛使用,在本研究中,我们通过体外实验结合体内实验,探究七氟醚对卵巢癌细胞的影响以及其中相关的分子机制。第一部分七氟醚对卵巢癌细胞增殖、转移和凋亡等的影响研究目的:七氟醚处理卵巢癌细胞后,通过多项细胞功能检测方法,探究七氟醚对卵巢癌细胞的增殖、转移、存活凋亡以及肿瘤相关信号通路的影响。方法:使用不同浓度的七氟醚处理卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3,通过CBiomedical technologyCK8法检测经七氟醚各个浓度处理后的细胞活性,计算IC50值,后续实验以IC50*60%浓度进行。经七氟醚处理卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3后,利用克隆形成实验、细胞周期实验和Western blot、流式细胞术和Western blot、划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞的克隆形成能力、细胞周期的变化、细胞凋亡的变化以及细胞迁移和侵袭能力的变化,明胶酶谱实验检测卵巢癌细胞分泌的MMP9的活性,Western blot检测PI3K/AKT信号通路蛋白标志物的表达水平。结果:七氟醚能够抑制卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的生长,并呈现剂量依赖性。七氟醚处理卵巢癌细胞后,能显著抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力,细胞被阻滞在G0/G1期,细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的表达显著降低。并且,卵巢癌细胞的早期和中期凋亡细胞的占比较对照组升高,细胞蛋白中具有抗凋亡活性的Bcl-2蛋白的的表达水平收到了抑制,对细胞凋亡有促进作用的蛋白Bax和激活的Active-Caspase3的表达较对照组发生了升高现象,细胞迁移和侵袭能力也相应的发生下降,在侵袭过程中发挥重要作用的分泌型MMP9蛋白活性受到七氟醚的抑制。此外,卵巢癌细胞中p-AKT和p-mTOR的磷酸化水平显著降低,与增殖相关的p70S6k蛋白表达下调。结论:本研究显示七氟醚能够抑制卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的细胞活性,并且这种抑制作用呈剂量依赖性。此外,七氟醚通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活进而抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。第二部分七氟醚通过下调STC1的表达抑制卵巢癌细胞恶性行为的机制研究研究目的:通过转录组测序,筛选出经七氟醚处理后卵巢癌细胞中差异显著变化的基因STC1,并通过实验进一步明确七氟醚通过调控STC1的表达参与抑制卵巢癌细胞的恶性行为。方法:卵巢癌细胞经七氟醚处理,收集细胞总RNA后进行转录组测序分析。根据测序结果进行聚类分析,筛选出两株细胞中共同上调和下调的基因,使用QPCR法进行验证。免疫组化实验检测卵巢癌组织芯片中STC1的表达水平并对其与临床病理的相关性进行统计分析。通过CCK8实验、流式细胞术检测和Transwell拯救实验检测七氟醚对卵巢癌细胞的增殖活性、细胞凋亡能力以及与细胞运动能力相关的迁移和侵袭的影响。通过Western blot蛋白免疫印迹实验检测经七氟醚处理后同时过表达STC1对PI3K/AKT信号通路的影响。体内裸鼠成瘤实验检测七氟醚和STC1的过表达对卵巢癌细胞成瘤能力PF-6463922纯度的影响。最后在裸鼠瘤中通过免疫组化检测STC1的表达水平。结果:卵巢癌细胞经七氟醚处理后的转录组测序分析结果显示,在SKOV3细胞中,有259个基因显著上调,117个基因显著下调,在OVCAR3细胞中,有338个基因显著上调,205个基因显著下调。聚类分析发现在两株细胞中共同上调的基因有26个,共同下调的基因有10个。挑选六个表达差异显著的癌基因进行后续的Q-PCR实验验证,结果显示STC1基因显著下调。Western blot实验证实了在卵巢癌细胞中七氟醚抑制STC1蛋白的表达。免疫组化检测结果显示,在卵巢癌组织细胞中,STC1蛋白表达定位于细胞核和细胞质中。STC1在卵巢癌组织细胞中着色更深,阳性细胞比例更高;在卵巢癌旁组织细胞中,STC1蛋白着色浅,阳性细胞比例低。病理分析结果显示,在卵巢癌中,STC1的表达与年龄相关(P=0.033),同时,STC1的表达和病理分级相关(P=0.037),但是与肿瘤的大小不相关(P=0.14)。在卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞中,过表达STC1后,细胞的增殖能力显著增加、凋亡能力显著降低、迁移和侵袭能力显著增加,并部分解除七氟醚对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡的促进作用。过表达STC1能够激活AKT信号通路及下游关键蛋白的表达,并部分解除七氟醚对AKT通路的抑制作用。七氟醚显著抑制裸鼠成瘤能力,而STC1过表达组的裸鼠瘤明显大于对照组,且七氟醚的抑瘤作用因STC1的过表达而被部分缓解,实验结果趋势与细胞实验结果趋势一致。免疫组化的结果显示,七氟醚处理组的裸鼠瘤STC1表达水平显著下降,经七氟醚处理同时过表达STC1组的STC1水平得到恢复,过表达组的STC1水平最高。结论:七氟醚通过调控STC1的表达进而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活,并抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为及裸鼠瘤的生长。第三部分 七氟醚通过调控STC1/ITGB6轴抑制卵巢癌细胞的恶性进展研究目的:通过免疫共沉淀实验,选择出与STC1相互作用的蛋白ITGB6,并通过实验MLN8237分子量进一步明确ITGB6在七氟醚通过调控STC1的表达抑制卵巢癌细胞恶性行为中具有不可或缺的作用。方法:GEPIA网站分析STC1与ITGB6的表达关系,并利用免疫共沉淀实验检测STC1和ITGB6的关系。通过Western blot和免疫组化实验检测ITGB6在卵巢癌细胞和组织中的表达。Western blot实验检测过表达STC1同时敲低ITGB6对AKT/mTOR信号通路的影响。CCK8、流式细胞术和Transwell拯救实验检测七氟醚通过抑制STC1/ITGB6的表达影响细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。结果:免疫共沉淀实验发现STC1和ITGB6结合。ITGB6在卵巢癌细胞和组织中高表达。STC1过表达能够激活AKT信号通路,敲低ITGB6则能够抑制AKT信号通路及相应蛋白的活化,而过表达STC1的同时敲低ITGB6能够部分缓解STC1的过表达对AKT信号通路的激活作用。在七氟醚+STC1过表达组中加入敲低的ITGB6,STC1对卵巢癌增殖、迁移和侵袭的促进作用部分被解除,并部分解除STC1对卵巢癌凋亡的抑制作用。结论:七氟醚通过调控STC1/ITGB6的表达进而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活,并抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。