背景:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC),亦称大肠癌,为临床上最常见的消化道恶性肿瘤,发病率位居全球第三位,死亡率高居第二位。目前临床上结直肠癌常见的化疗药物有5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、伊立替康(Irinotecan)、卡培他滨(Capecitabine)和亚叶酸钙等,这些药物均具有明显的肝脏毒性,因此开发新型结直肠癌治疗药物刻不容缓。近年来,花菁衍生物开始被应用在抗肿瘤领域研究。在一定波长的辐射下,七甲川花菁(Heptamethine cyanine,Cy7)及其衍生物可以产生活性氧(reactive oxygen speciest,ROS),这一特点为Cy7诱导结直肠癌细胞死亡提供可能。光敏疗法是肿瘤治疗中一种非常具有前途的策略,包括光www.selleck.cn/products/mcc950-sodium-salt动力疗法(photothermal therapy,PDT)和光热疗法(photodynamic therapy,PTT)。光敏疗法具有很多优点,例如:微创性、准确治疗和副作用少,但其也具有一定的缺点,例如:对深层次的肿瘤效果甚微,而化学治疗对深部肿瘤效果更好。基于此,本课题组自主设计合成了一种Cy7衍生物Cy7-Cl,不需要光敏疗法即可在体内外均表现出显著的抗结直肠癌活性。且Cy7-Cl显著引起结直肠癌细胞HCT116、SW480、DLD-1和MC38细胞ROS含量和凋亡率升高。在这一过程中我们观察到结直肠癌细胞线粒体形态变化,结直肠癌细胞呈现出凋亡(Apoptosis)的特征。目的:本课题从体内外探究Cy7-Cl抗结直肠癌活性,并深入探究Cy7-Cl诱导结直肠癌发生凋亡的作用机制,最终阐明Cy7-Cl阻滞结直肠癌的药理机制。方法:首先应用MTT、平板克隆-结晶紫染色实验研究Cy7-Cl体外抗结直肠癌活性。随后应用BALB/C裸鼠建立结直肠癌细胞MC38皮下荷瘤模型,经尾静脉注射5 mg/kg/2d剂量的Cy7-Cl治疗20天,研究Cy7-Cl体内阻滞结直肠癌。通过体重监测、血常规检测、肝肾功能检测、HE染色等实验方法评估Cy7-Cl对BALB/C裸鼠的毒副作用。最后通过小分子抑制剂筛选、流式细胞术、蛋白质印迹、Mito-Green探针染色、JC-1染色、DCFH-DA探针染色等技术深入探究Cy7-Cl的作用机制。结果:1.Cy7-Cl体内外显著阻滞结直肠癌且具有良好的肿瘤靶向性。MTT实验表明Cy7-Cl显著诱导结直肠癌细胞活力下降。克隆形成实验确证Cy7-Cselleck产品l阻滞结直肠癌细胞活力,结果表明Cunderlying medical conditionsy7-Cl显著抑制结直肠癌细胞增殖。应用MC38细胞建立皮下荷瘤模型,尾静脉注射干预试剂,结果显示,与生理盐水组相比,Cy7-Cl干预组肿瘤体积显著减小;Cy7-Cl干预组细胞核染色较浅,细胞核分裂少,表明Cy7-Cl在体内抑制结直肠癌皮下荷瘤的生长。治疗结束后对主要脏器进行生化指标、脏器系数及血常规检测。结果显示,与生理盐水组相比,Cy7-Cl未显著引起裸鼠毒副作用。同前述建立MC38细胞BALB/C裸鼠皮下荷瘤模型,尾静脉注射5 mg/kg Cy7-Cl后采用小动物活体成像技术定时观察药物在肿瘤的富集情况,结果表明尾静脉注射Cy7-Cl 10-24 h后Cy7-Cl偏向分布于肿瘤部位。2.Cy7-Cl通过线粒体凋亡途径诱导结直肠癌细胞死亡。为了进一步探究Cy7-Cl的作用机制,我们应用不同的小分子抑制剂与Cy7-Cl联合作用,检测小分子抑制剂对Cy7-Cl抑制结直肠癌细胞活力的影响。结果显示,凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、抗氧化剂NAC显著逆转Cy7-Cl诱导的细胞活力下降。应用Annexin V-FITC/PI双染法、Tunel染色法、Hoechst 33342/PI染色法和蛋白质印迹等实验方法确认Cy7-Cl诱导结直肠癌细胞凋亡。且Z-VAD-FMK、NAC显著逆转Cy7-Cl诱导的结直肠癌细胞凋亡。3.Cy7-Cl定位到结直肠癌细胞线粒体并诱导线粒体功能障碍。应用Mito-Green探针确定Cy7-Cl的线粒体定位能力,结果表明,Cy7-Cl具有良好的线粒体定位及靶向能力。随后我们应用线粒体膜电位JC-1探针染色,结果表明,Cy7-Cl诱导结直肠癌细胞线粒体膜电位下降。线粒体是产生ATP的主要部位,进一步应用ATP检测试剂盒确定Cy7-Cl对ATP产生的影响。结果显示,Cy7-Cl显著降低ATP的产生,且呈现剂量依赖性。以上结果表明,Cy7-Cl定位到结直肠癌细胞线粒体并诱导线粒体功能障碍。4.Z-VAD-FMK、NAC显著逆转Cy7-Cl诱导的ROS含量升高。线粒体是ROS的主要来源,ROS是引起线粒体损伤的主要途径之一,我们应用DCFH-DA探针染色法检测细胞的ROS含量。结果表明,Cy7-Cl诱导结直肠癌细胞ROS含量升高。凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和抗氧化剂NAC显著逆转Cy7-Cl诱导的ROS含量升高。5.Cy7-Cl在体外经AMPK介导凋亡阻滞结直肠癌。由于AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在线粒体功能和细胞凋亡中起重要作用,本课题应用蛋白质印迹检测AMPK相关蛋白表达,结果显示AMPK、phospho-AMPKα(Thr172)的表达量升高。化合物C(Compound C,CC)作为AMPK的抑制剂能够显著逆转Cy7-Cl诱导的细胞活力下降、ROS含量升高和凋亡率升高。低表达AMPKα2显著逆转Cy7-Cl诱导的结直肠癌细胞凋亡,且显著逆转Cy7-Cl诱导的细胞活力下降和ROS含量升高。二甲双胍作为AMPK的激动剂和高表达AMPKα2结果反之。6.Cy7-Cl在体内经AMPK介导的凋亡阻滞结直肠癌。7.Cy7-Cl与结直肠癌上市药物联合使用促进结直肠癌细胞发生凋亡。结论:Cy7-Cl在体外显著抑制结直肠癌细胞增殖,在体内偏向分布于结直肠癌皮下荷瘤部位,并显著抑制结直肠癌皮下荷瘤的生长,且对荷瘤模型裸鼠无显著异常的毒副作用。Cy7-Cl可通过AMPK影响线粒体,导致线粒体膜电位下降,ATP含量下降,进而影响Bax和Bcl-2的表达,随后影响Cyt c从线粒体释放到胞浆,导致ROS含量升高,激活Cleaved Caspase-3酶活性,最终诱导结直肠癌细胞凋亡。