丙烯酰胺(Acrylamide,AA)作为热加工食品美拉德反应的重要产物,具有生殖毒性、神经毒性、肝毒性和潜在的致癌性。肝脏是AA代谢的主要场所也是AA攻击的主要靶器官,热加工食品中AA的肝毒性引起广泛关注。AA诱导的肝毒性与氧化应激关系密切,线粒体ROS(mt ROS)引发的线粒体氧化应激是机体氧化应激的主要来源。氧化应激直接参与铁死亡和细胞焦亡等细胞死亡方式。铁死亡依赖铁medicinal cannabis离子,以脂质过氧化和抗氧化系统失调为特征。氧化应激通过激活炎性小体,诱导炎症因子释放,打开细胞焦亡经典通路。本研究旨在通过建立AA染毒大鼠肝星状细胞(HSC-T6细胞)模型,探究AA对HSC-T6细胞mt ROS释放以及诱导铁死亡、细胞焦亡发生的机制,进一步阐明mt ROS对铁死亡和细胞焦亡的作用,为最终揭示AA肝毒性机制奠定研究基础。本论文主要研究内容及结果如下:(1)AA损伤HSC-T6细胞线粒体功能并释放mt ROS。建立AA(0,0.5,1,2 m M)染毒HSC-T6细胞模型,通过检测LDH、ALT和AST的水平变化,HSC-T6细胞被2 m M AA处理后LDH、ALT和AST水平值分别为对照组的1.4、2.9、3.5倍,确定AA对细胞造成损伤;通过Western Blot考察HSC-T6细胞膜孔蛋白VDAC1表达水平,测定线粒体膜电位(MMP),ATP水平以及透射电镜观察线粒体结构,得出AA诱导VDAC1蛋白表达升高,MMP和ATP水平下降,线粒体结构受损,确定AA造成线粒体结构功能损伤;通过检测mt ROS释放水平,确定AA增加mt ROS释放量。(2)AA诱导的mt ROS释放致XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡,引发HSC-T6细胞铁死亡。通过Western Blot对HSC-T6细胞铁死亡关键蛋白表达水平考察,测定HSC-T6细胞GSH、MDA和Fe~(2+),得出AA影响关键蛋白表达,提高MDA和Fe~(2+)水平含量,下调GSH水平,确定AA影响HSC-T6细胞XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路;采用5μM铁死亡抑制剂Fer-1,通过Western Blot3-Methyladenine价格考察HSC-T6细胞铁死亡关键蛋白表达水平,测定GSH、MDA和Fe~(2+),确定AA通过造成XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡诱导HSC-T6细胞铁死亡;通过加入50μM mt ROS清除剂Mito-TEMPO检测铁死亡关键蛋白表达,得出Mito-TEMPO恢复XCT-GSHTelaglenastat-GPX4抗氧化系统,确定AA诱导HSC-T6细胞mt ROS释放促进铁死亡的发生。(3)AA诱导mt ROS释放激活NLRP3-caspase1-GSDMD通路致HSC-T6细胞焦亡。通过对SOD酶活性和ROS释放水平检测,得出AA诱导ROS释放量增加,SOD酶活性受到抑制,确定AA诱导氧化应激;通过Western Blot考察NLRP3-caspase1-GSDMD通路相关蛋白表达情况、通过试剂盒检测下游炎症因子水平,发现AA上调NLRP3、GSDMD、caspase1蛋白表达和IL-18、IL-1β炎症因子释放水平,确定AA激活NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路致HSC-T6细胞焦亡;通过加入mt ROS清除剂Mito-TEMPO检测细胞焦亡关键蛋白表达,得出Mito-TEMPO抑制NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路,确定AA诱导HSC-T6细胞mt ROS释放促进细胞焦亡的发生。综上所述,AA通过诱导线粒体功能障碍从而释放mt ROS。mt ROS能够诱导XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡致HSC-T6细胞铁死亡。又通过激活NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路诱导HSC-T6细胞焦亡。