中药五味子是五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实,因其具有酸、苦、甘、辛、咸五味而得名。现代药理学研究证明,联苯环辛烯类木脂素,具有联苯键和环辛二烯环,是五味子的主要活性成分,具有保肝、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等良好活性,临床需求量大。但是五味子植物生长周期长,有效成分含量低,提取分离纯化步骤繁琐,野生资源越来越少且人工栽培起步较晚,所以亟需开发新的资源供给模式。近些年来,由于中药资源的可持续利用一直是个热门话题,植物天然产物合成生物学应运而生,越来越多的中药活性成分已经通过合成生物学策略实现了新的供给模式。综上所述,基于联苯环辛烯类木脂素结构独特和活性显著的特点,引起了团队对此类化合物生物合成途径解析的极大兴趣。2007年,日本京都大学的学者Shiro Suzuki和Toshiaki Umezawa对各种结构类型木脂素类化合物的生物合成途径进行了总结和推测,其中对联苯环辛烯类木脂素生物合成途径的推测是:前体物质松柏醇被催化生成异丁香酚,接下来异丁香酚发生二聚化反应生成渥路可脂素,渥路可脂素接着发生开环反应生成二氢愈创木脂酸,最后二氢愈创木脂酸经分子内芳基偶联反应形成联苯键产生联苯环辛烯类木脂素戈米辛A。有学者从矮牵牛(Petunia×hybrida)中分离出两个酶PhCFAT和PhIGS1,前者能够催化松柏醇生成乙酸松柏酯,后者能够催化乙酸松柏酯生成异丁香酚。因此,松柏醇酰基转移酶(coniferyl alcohol acyltransferase,CFAT)和异丁香酚合酶(isoeugenol synthase,IGS)作为继松柏醇之后的前两个限速酶,它们对于联苯环辛烯类木脂素的积累以及生物合成途径的解析至关重要。为了鉴定五味子中编码CFAT和IGS的基因,本研究基于不同发育时期五味子果实的转录组数据库进行了基因家族的鉴定和生物信息学分析,不仅对五味子基因家族的功能进化有了系统的认识,还筛选得到了关键候选基因,并通过体外酶促反应和底物饲喂的方式从五味子中鉴定到两个具有催化活性的酶ScCFAT和ScIGS1。现将主要研究内容及结果叙述如下:1.首先为了明确五味子中是否存在编码CFAT和IGS的基因,本研究使用气质联用仪对五味子果实乙酸乙酯PS-341说明书提取物和异丁香酚标准品溶液进行了检测,通过比对发现五味子果实中富含大量顺、反式异丁香酚混合物,以反式异丁香酚为主。因此,可以明确五味子中存在编码CFAT和IGS的基因,另一方面也进一步证实了联苯环辛烯类木脂素生物合成途径的可靠性。2.为了对五味子BAHD酰基转移酶家族有系统的了解并发掘编码CFAT的候选基因,本论文基于五味子果实转录组数据库对BAHD酰基转移酶家族成员进行了系统的鉴定和生物信息学分析。一共鉴定出37条ScBAHD氨基酸序列,与其它物种中共计75条BAHD酰基转移酶序列共同构建了系统发育树。结果显示,所有BAHD酰基转移酶划分为五大分支,除了第Ⅳ分支之外,37条ScBAHD在其它分支中均有分布。其中,ScBAHD1、ScBAHD3和ScBAHD7分布在第Ⅲ分支中,与PhCFAT的亲缘关系最近。表达模式分析表明,只有ScBAHD1表达水平的变化符合联苯环辛烯类木脂素在五味子不同发育时期果实中的积累模式,因此被选为候选基因用于后续研究。3.为了验证ScBAHD1是否具有松柏醇酰基转移酶的催化活性,本研究通过同源重组技术将其开放阅读框(openreadingframe,ORF)连接在原核表达载体上,以PhCFAT作为阳性对照,通过体外酶促反应发现ScBAHD1能够催化松柏醇和乙酰辅酶A产生与阳性对照组相同的产物乙酸松柏酯,所以将其命名为ScCFAT。此外,对ScCFAT进行底物多样性研究发现它只对醇羟基具有乙酰化活性,对酚羟基尚未检测到催化活性。ScCFAT的亚细胞定位分析结果表明其主要定位于烟草叶片的细胞质中。同源建模所得ScCFAT的三维晶体结构符合BAHD酰基转移酶家族成员三维结构的基本特征。最后,通过丙氨酸筛查的方式明确了 His158是ScCFAT的关键残基,突变之后会导致其完全失去催化活性。4.为了对五味子PIP还原酶家族有系统的了解并发掘编码IGS的候选基因,本研究基于五味子果实转Medical ontologies录组数据库对PIP还原酶家族成员进行了系统的鉴定和生物信息学分析。一共鉴定出9条ScPIP氨基酸序列,与其它物种中的32条PIP还原酶序列共同构建了系统发育树。结果显示,所有PIP还原酶一共划分为四大分支,9条ScPIP散布在四个分支中。其中,ScPIP1处于第Ⅳ分支中,与PhIGS1的亲缘关系最近。ScPIP2和ScPIP4位于第Ⅲ分支中,该分支中包含一些丁香酚合酶(eugenol synthase,EGS)成员。实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测结果表明,ScPIP1和ScPIP2表达水平的变化趋势与ScCFAT的表达模式基本一致,ScPIP4却一直呈现出较低的表达水平。最终,本研究选择对ScPIP1、ScPIP2和ScPIP4这三条基因进行克隆及功能研究。5.为了验证ScPIP1、ScPIP2和ScPIP4是否具有异丁香酚合酶或者丁香酚合酶的催化活性,本研究将它们的ORF序列连接在原核表达载体上,将松柏醇饲喂孵育重组质粒的大肠杆菌,利用大肠杆菌内源性酰基转移酶乙酰化松柏醇生成乙酸松柏酯作为底物。检测发现,ScPIP1组和阳性对照PhIGS1组的大肠杆菌在培养基中释放出了异丁香酚,但是ScPIP2、ScPIP4以及空载体组既没有产生异丁香酚,也没有产生丁香酚,所以将ScPIP1命名为ScIGS1。亚细胞定位分析结果显示,ScIGS1主要定位于烟草叶片的细胞质及细胞核内。同源建模所得ScIGS1的三维晶体结构符合PIP还原酶家族成员三维结构的基本特征。通过定点突变实验发现,110位和113位氨基酸都会影响ScIGS1催化产物的组成及比例,His113突变为Tyr不会改变产物组成,Lys157突变为Ala会导致ScIGS1完全失去催化活性。最后,对ScIGS1及其5个突变体的酶转换数(kcat)进行预测发现5个突变体的kcat值均小于ScIGS1的kcat值,表明突变之后酶的催化活性降低。综上所述,本研究首次基于前人对联苯环辛烯类木脂素生物合成途径的推测开展了一系列基因家族鉴定和生物信息学分析,从五味子中克隆得到联苯环辛烯类木脂素生物合成途径上编码CFAT和IGS的cDNA全长基因,并且进行了功能验证,是联苯环辛烯类木脂素生物合成途径解析的开拓性进展。此外,这两个基因将有利于后续通过共表达分析结合基因家族分析发掘出更多www.selleck.cn/products/r-gne-140可能参与下游催化反应的候选基因,旨在早日完全解析联苯环辛烯类木脂素的生物合成途径,从而实现利用微生物细胞工厂异源生产联苯环辛烯类木脂素以及通过分子选育开发优质新品种的目标。