目的:天麻先蒸制后干燥的产地加工方法从宋代一直沿用至今,2020版《中国药典》规定天麻的产地加工方法为“立即洗净,蒸透,敞开低温干燥”。由于天麻产地加工过程的生化反应及作用机理不清,导致在实际的生产中并未形成一套规范的天麻产地加工方法,导致天麻药材质量参差不齐。本课题旨在研究天麻产地加工对其化学成分及抗炎活性的影响,阐明天麻抗炎的药效物质基础和作用机制,从而揭示天麻产地加工的科学内涵,为规范天麻产地加工,提升天麻药材品质提供理论支持。方法:1、天麻产地加工对化学成分的影响研究。采用控制变量法,建立了5种天麻加工方法,其中(1)45 ℃烘干vs.蒸制+45 ℃烘干:考察蒸制时的高温对酶和化学成分的影响;(2)45 ℃烘干vs.超高压灭酶+45 ℃烘干:考察直接烘干时水解酶对化学成分的影响;(3)超高压灭酶+蒸制+45 ℃烘干vs.超高压灭酶+45 ℃烘干:考察高温对化学成分的影响;(4)超高压灭酶+45 ℃烘干vs.超高压灭酶+冻干:考察低温干燥对化学成分的影响。建立5种天麻加工品的HPLC指纹图谱,确定共有峰;然后采用聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和偏最小二乘—判别分析(OPLS-DA)对5种加工样品进行聚类,并分析其差异性成分;最后对5种天麻加工品中的主要成分进行含量测定。从化学角度阐明天麻产地加工过程中的高温蒸制和低温烘干对天麻品质的影响。2、天麻蒸制过程中化学成分的“时间—空间—含量”变化规律研究。选取5块天麻分别蒸制0 min、2 min、4 min、6 min、8min,室温下放置24 h后切片;优化喷涂基质,建立一种对天麻中的酚类成分高覆盖可视化分析的基质辅助激光解析质谱成像(MALDI-MSI)方法,结合液—质联用(LC-MS)对不同蒸制时间下天麻切片中酚类化合物进行成像、鉴定和分析,研究天麻蒸制过程中酚类成分的“PF-02341066抑制剂时间—空间—含量”变化;进行β-葡萄糖苷酶(β-GC)对天麻素(GAS)的体外酶解实验。3、天麻抗炎活性的谱—效关系研究。建立脂多糖(LPS)诱导的小鼠小胶质细胞(BV-2)炎症模型,使用MTT法考察天麻不同提取部位的细胞毒性,以NO、TNF-α和IL-6为指标筛选天麻的抗炎活性部位,并比较天麻蒸制前后的抗炎活性变化;建立10批商品天麻活性部位的HPLC指纹图谱,标定其共有峰,并采用LC-MS对共有峰进行鉴定;采用偏最小二乘回归分析法(PLS)和灰色关联度法(GRA)建立谱—效关系,分析其化学成分与NO、TNF-α和IL-6分泌抑制作用的相关性,以确定天麻发挥抗炎作用的潜在物质基础。4、天麻发挥抗炎作用的药效物质确证及作用机制研究。测定潜在药效物质对LPS诱导的BV-2细胞炎症模型中炎症介质(NO、ROS、TNF-α、IL-6、i NOS和COX-2)水平,结合分子对接技术预测天麻发挥抗炎作用的相关信号通路及与关键靶点蛋白,并基于LPS诱导的BV-2细胞炎症模型和蛋白质印迹技术(Western blot)进行体外验证,考察潜在药效物质对相关信号通路主要靶点蛋白表达的影响,对天麻发挥抗炎作用的化学成分及作用机制进行研究和确证。结果:1、系统的阐明了天麻产地加工对化学成分的影响。HPLC指纹图谱共标定了天麻素(GAS)、对羟基苯甲醇(4-HBA)、巴利森苷A(PA)、巴利森苷B(PB)、巴利森苷C(PC)和巴利森苷E(PE)为5组天麻样品的共有峰。HCA、PCA和OPLS-DA结果表明,直接烘干和蒸制后烘干的天麻样品分别聚为一类,而经超高压处理的3组天麻样品聚为一类,影响聚类的主要差异性成分为4-HBA和PA。含量测定结果表明,直接烘干的天麻中4-HBA含量显著高于其他处理组(P<0.001),PA和PE含量显著低于其他处理组(P<0.001);蒸制处理的天麻与超高压处理后再蒸制的天麻相比,PA含量较低(P<0.01);另外,烘干处理与冻干处理的天麻中的化学成分含量没有明显差异。说明蒸制可以灭活水解酶,抑制了巴利森苷类成分的降解;而蒸制时的高温也有促进PA转化的降解;另外低温烘干对巴利森苷类成分的降解作用不明显。2、直观呈现了天麻的酚类成分在蒸制过程中的“时间—空间—含量”变化。实验优化得到1,5-二氨基萘(1,5-DAN)作为喷涂基质,利用基质辅助激光解析质谱成像技术可以在天麻切片中检测到13种酚类成分(包括11种巴利森苷类化合物),分别是PA、PT/PU、PK、PB/PC、PW、PJ、PE/PG、PD、4-HBA和CA。随着蒸制时间的增加,CA、4-HBA、PD和PW在切片中的分布由外向内逐渐减少,而PA、PT/PU、PK、PB/PC、PW和PE/PG等大分子巴利森苷在切片中的分布呈现出由外向内逐渐扩散的显著趋势。而天麻中的小分子成分是在羧酸酯酶(Car E)和β-葡萄糖苷酶(β-GC)的作用下由大分子巴利森苷通过断裂酯键和β-葡萄糖苷键形成的,这两种水解酶的失活时间与蒸至“透心”的时间一致。体外酶解实验表明蒸制可以灭活β-GC,抑制GAS的脱葡萄糖降解。以上结果均证明天selleck麻在蒸制过程中可以灭活Car E和β-GC,从外向内保护巴利森苷。基于此,本研究还总结了巴利森苷在Car E和β-GC作用下的降解途径。3、证实了天麻经蒸制可以显著提高抗炎活性,GAS、4-HBA、PA、PB和PC是潜在活性物质。MTT结果表明天麻的70%乙醇提取物和二氯甲烷部位对BV-2细胞有细胞毒性。建立了LPS诱导的BV-2炎症模型,以NO、TNF-α和IL-6为指标,对天麻正丁醇相和水相进行抗炎活性筛选,发现正丁醇相抗炎效果较好,确定为天麻药用部位。以NO、TNF-α和IL-6为指标,对先蒸制后烘干和直接烘干的两种天麻样品的抗炎活性进行比较,结果表明经蒸制的天麻其抗炎活性显著提高。建立了10批商品天麻正丁醇相的指纹图谱,确定了12个共有峰,经LC-MS共鉴定得到11个成分,分别为4,4′-dihydroxybenzyl sulfoxide(峰1)、柠檬酸(峰2)、bis-(4-hydroxybenzyl)sulfide(峰3)、天麻素(峰4)、甲基柠檬酸(峰5)、对羟基苯甲醇(峰6)、巴利森苷E(峰8)、巴利森苷J(峰9)、巴利森苷B(峰10)、巴利森苷C(峰11)、巴利森苷A(峰12)。12个共有峰的峰面积结合10批商品天麻正丁醇相对LPS诱导的BV-2炎症模型NO、TNF-α和IL-6的释放抑制率,建立天麻正丁醇部位的抗炎作用谱—效关系。在PLS中,峰4、6、10、11与药效呈正相关,且VIP值大于1;在GRA中,12个共有峰与NO抑制作用密切相关的排名前5的是6>4>7>12>10;与TNF-α的分泌抑制作用密切相关的排名前5的是4>2>6>10>12;而与IL-6的分泌抑制作用密切相关的排名前5的是6>4>7>12>10。综合以上结果,峰4(GAS)、峰6(4-HBA)、峰10(PB)、峰11(PC)和峰12(PA)为天麻正丁醇部位发挥抗炎活性的潜在物质基础。4、证明了PB的抗炎活性及其作用机制。PB可以抑制LPS刺激下BV-2细胞炎症介质(NO、胞内ROS、TNF-α以及IL-6)的释放及i NOS的活性和COX-2的水平的提高,表明PB可减轻LPS引起的BV-2神经细胞炎症。Western Blot结果表明PB可以通过抑制LPS诱导的IKKβ、IκBα和p65的磷酸化,从而抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的激活发挥抗炎作用。分子对接技术预测得到PB与AMPKα和SIRT1蛋白的结合能力良好,分别为-12.1 k J·mol~(-1)和-7.6 k J·mol~(-1),推测PB可能作用于AMPKα/SIRT1蛋白调控下游NF-κB炎症信号通路。Western Blot结果表明,LPS可以抑制AMPKα的磷酸化和SIRT1的表达,而PB可活化AMPKα和SIRT1靶点蛋白,通过抑制AMPK/SIRT1信号传导发挥抗炎作用。综上,PB通过激活AMPK/SIRT1通路,进而抑制NF-κB通路,发挥抗LPS诱导的BV-2神经炎症作用。结论:综上所述,天麻的产地加工具有抑制巴利森苷的酶促降解、促进化学转化的作用;其在蒸制过程中可以灭活水解酶,由外向内抑制大分子巴利森苷的降解。天麻的正丁醇部位是发挥抗炎作用的活性部位,且天麻经蒸制后抗炎活性显著提高,其潜在的药效物质基础是GAS、4-HBA、PA、PB和PC。其中PB通过激活AMPK/SIRT1通路,进而抑制NF-κB通路,发挥抗LPS诱导的BV-2神经炎症作用。本研究通过对“产地加工—成分变化—药理作用Selenocysteine biosynthesis—品质形成”的关联研究,阐明了产地加工促进天麻品质形成的科学内涵,为建立科学、规范的天麻产地加工工艺和质量评价体系、基于天麻药效成分的新药研发提供理论依据,对推动中药学学科发展,促进中药农业高质量发展具有重要意义。