目的:神经炎症主要是发生在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中的炎症反应,涉及到中枢神经系统与免疫系统之间紧密的相互作用。体内各种免疫细胞释放出的炎症介质,可以激发机体先天性和适应性免疫应答反应。神经炎症的初期阶段会对机体产生保护作用,但是当中枢神经系统经受长期的炎症刺激时,神经元的功能会受到损伤甚至造成神经元死亡,突触丧失,进而导致患者出现认知障碍。许多神经系统疾病和年龄相关的神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症,都伴随着神经炎症的发生。目前还未发现行之有效的方法来治愈神经退行性疾病,因此,抑制神经炎症的发生为治疗神经退行性疾病提供了一个新的研究方向。间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)具有多向分化成各种细胞的能力,可以分泌多种生物活性因子,具有抗炎和免疫调节特性,移植后仅引起受体轻微的免疫排斥反应,因此,基于MSCs移植的干细胞疗法在疾病治疗和损伤修复的研究中被寄予厚望,在再生医学研究领域占有重要位置。人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUC-MSCs)由于其获得的便捷性和无痛性、较高的增殖分化潜能等优势,被学者们认为是间充质干细胞移植的重要细胞来源。现有的文献报道称,MSCs移植在神经炎症相关的认知功能障碍疾病上具有显著的治疗潜力,但其发挥作用的机制还不是十分明确。因此,本课题旨在探究移植人脐带间充质干细胞对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导小鼠脑内神经炎症的影响以及机制。研究方法:一、人脐带间充质干细胞安全性测试1、hUC-MSCs急性毒性实验:取40只C57BL/6小鼠,分为生理盐水对照组和hUC-MSCs处理组。注射生理盐水和hUC-M确认细节SCs后观察14天,记录小鼠体重数据,14天观察期结束后处死小鼠,取脏器称重、记录;2、溶血性实验:取新西兰白兔耳缘静脉血,除去纤维蛋白原,制成2%脱纤血液,分别与5个浓度梯度的hUC-MSCs溶液、生理盐水和蒸馏水孵育3小时,孵育结束后离心,取上清液测定OD_(570);3、血管刺激性实验:取新西兰白兔6只,分为对照组和hUC-MSCs组,通过耳缘静脉注射后,观察48小时内耳背的病变情况。48小时后处死白兔,取耳缘血管与周围组织进行固定、HE染色,观察病变情况;4、免疫毒性实验:取豚鼠分为阴性对照组、阳性对照组、hUC-MSCs注射组。采用皮下注射的方式致敏,致敏14天后采用耳缘静脉注射方式进行激发,观察并记录豚鼠的过敏反应症状。二、hUC-MSCs对LPS诱导小鼠神经炎症模型认知障碍的影响1、LPS诱导小鼠神经炎症模型:取C57BL/6小鼠,分为生理盐水对照组和LPS诱导组,连续7天进行腹腔注射造模,造模结束后进行Y迷宫和新物体识别检测;2、hUC-MSCs对LPS诱导神经炎症小鼠认知障碍的影响:取C57BL/6小鼠,分为生理盐水对照组、LPS处理组、LPS+hUC-MSCs处理组,造模结束后进行Y迷宫和新物体识别检测。三、hUC-MSCs对LPS诱导神经炎症的影响1、hUC-MSCs对LPS诱导BV2细胞炎症的影响:将BV2细胞分为PBS对照组、LPS诱导组、LPS诱导后与hUC-MSCs共培养组,ELISA检测BV2细胞培养上清液中TNF-α和IL-6表达的变化;免疫荧光法检测BV2细胞的M1极化水平;2、hUC-MSCs对LPS诱导小鼠神经炎症的影响:将C57BL/6小鼠分为生理盐水对照组、LPS诱导组、LPS诱导后尾静脉注射hUC-MSCs组(LPS+hUC-MSCs处理组)。造模结束后,通过ELISA检测小鼠海马和皮质中TNF-α和IL-6表达的变化;免疫荧光法检测小鼠海马和皮质中小胶质细胞的M1极化水平。四、TSG-6在hUC-MSCs缓解LPS诱导神经炎症过程中的作用1、从GEO数据库中查询关于间充质干细胞在炎症条件下差异基因表达的数据集;对其筛选后进行GO分析,结合文献报道,确定下一步实验的研究对象;2、检测hUC-MSCs分泌TSG-6蛋白情况:采用ELISA检测hUC-MSCs和HBMECs培养上清液中TSG-6含量;3、人重组TSG-6蛋白对LPS诱导BV2细胞炎症的影响:实验分为PBS对照组、LPS处理组、LPS+rh TSG-6处理组,用ELISA检测BV2细胞培养上清液中TNF-α和IL-6表达的变化;免疫荧光法检测BV2细胞的M1极化水平;4、人重组TSG-6蛋白对LPS诱导小鼠神经炎症的影响:分为生理盐水对照组、LPS处理组,LPS+rh TSG-6处理组。造模结束后,用Y迷宫和新物体识别检测小鼠认知变化。用ELISA检测各组模型小鼠海马和皮质中TNF-α和IL-6表达的变化;免疫荧光法检测小鼠海马和皮质中小胶质细胞的M1极化水平。结果:1、本研究中使behavioral immune system用的人脐带间充质干细胞,在经过体内外实验检测后,未出现急性毒性、溶血性和血管刺激性、免疫毒性反应,提示其具有生物安全性;2、通过腹腔注射LPS诱导制备的神经炎症模型小鼠,会产生认知障碍,而注射hUC-MSCs后,认知障碍得到缓解;3、hUC-MSCs会降低由LPS诱导产生的体内外神经炎症模型中TNF-α和IL-6表达升高和小胶质细胞M1极化增加;4、hUC-MSCs可以分泌TSG-6蛋白;静脉注射人重组TSG-6蛋白可以削弱由LPS诱导的神经炎症模型中TNF-α和IL-6表达的升高和小胶质细胞M1极化增加,并缓解了神经炎症小鼠的认知障碍。结论:hUC-MSCs具有生物学安全性,尾静脉注射的hUC-MSCs可能是通过其释放的TSG-6缓解由LPS诱导的小鼠神经炎症以及认知Decitabine细胞培养障碍。