β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)是一种生物活性核苷酸。NMN在抵抗个体衰老、预防以及治疗神经退行性疾病和糖尿病等方面发挥积极作用。全细胞催化经济环保,反应过程特异性高,在NMN的生产中具有良好的应用前景。本研究以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)作为出发菌株,采用基因工程的策略对其进行适当的改造,利用底物葡萄糖和烟酰胺高效合成NMN,为NMN的生物合成做出探索。主要研究如下:(1)筛选高活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide pCell Biology Serviceshosphoribosyltransferase,Nampt/NadV)。以来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、弧菌噬菌体KVP40(VibFerrostatin-1分子式rio bacteriophage KVP40)和松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)的Nampt/NadV作为酶源,在E.coli BL21(DE3)中分别表达,研究重组菌合成NMN的能力。实验结果发现,弧菌噬菌体KVP40来源的烟酰胺磷酸核糖转移酶(VpNadV)的活性最高,重组菌株的NMN产量为26.2±0.75 mg·L~(-1)。因此,选择VpNadV用于后续的研究。(2)构建VpNadV和大肠杆菌核糖磷酸二磷酸激酶(ribose phosphate pyrophosphokinase of E.coli,EcPRS)共表达质粒pETDuet-VpnadV-Ecprs,改造酶EcPRS以提高其活性,并优化其表达水平。结果表明,重组菌E.coli/pETDuet-VpnadV-Ecprs比VpnadV单独表达的菌株拥有更好的NMN合成能力。在EcPRS的所有突变体中,单个氨基酸残基突变的突变体EcPRS~(D115)表现出最佳酶活。在PRS表达水平的优化中,启动子P_(J23119)和RBS_Ⅲ的组合,在NMN的增产中表现最佳。(3)增强前体5-磷酸核糖二磷酸(5-phosphoribosyl diphosphate,PRPP)供应和削弱产物NMN降解。对PRPP合成途径进行改造,将基因zwf(编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)和基因gndA(编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)替换为谷氨酸棒杆菌来源的zwf~(A243T)和gnd~(S361F),过表达基因rpiA和rpiB(编码核糖-5-磷酸异构酶),增强了前体的合成。敲除支路代谢途径中的基因pfkA(编码6-磷酸果糖激酶),获得重组菌株ZY14,NMN的合成量再度提高。对产物NMN降解途径中的基因pncC(编码NMN氨基水解酶)和基因ushA(编码5’-核苷酸酶)敲除,NMN的降解被削弱,得到的重组菌株ZY16的NMN产量达到925.3±12.5 mg·L~(-1),相较于对照菌株ZY14提高1.74倍。(4)对性能最优的重组菌株ZY17,在摇瓶水平进行全细胞催化条件优化。最优的催化条件为:pH 8.0、催化温度35℃、摇床转速200 r·min~(-1)、Mg~(2+)6 mmol·L~(-1)。重组菌株ZY17在最优Gefitinib-based PROTAC 3价格条件下生物转化12 h,共产生NMN 2.37±0.03 g·L~(-1),是优化前的1.47倍。对反应体系进行放大试验,在2 L生物反应器内,NMN产量达到13.3±0.35 g·L~(-1),烟酰胺摩尔转化率为85.3%。