目的本研究基于课题组前期研究结果,于同一营养阶段,采集箭叶淫羊藿3个不同化学型居群叶片进行代谢组和转录组整合分析,绘制黄酮醇类活性成分合成通路图,筛选候选基因,探索质量差异形成机制。方法(1)箭叶淫羊藿代谢组分析。利用广泛靶向代谢组学方法,对同质园栽培3年以上箭叶淫羊藿3个质量和化学型差异较大的居群,即化学型为空白谱类安徽黄山居群(AHHS)、朝藿定C主导-普通类江西武宁居群(JXWN)和淫羊藿苷主导-朝藿定B强峰类湖北罗田居群(HBLT),于同一营养阶段采样,进行叶片代谢物进行整体表征和相对定量。对花青素类成分和总黄酮醇苷进行相关性分析。整合主成分分析、聚类分析、正交偏最小二乘判别分析和单变量统计分析,对3个居群整体代谢物进行分析和差异代谢物分析。通过KEGG数据库对差异代谢物进行KEGG功能注释及富集分析。(2)箭叶淫羊藿转录组分析。利用高通量转录组测序对箭叶淫羊藿3个居群叶片进行测序,使用Trinity软件进行转录本拼接获得转录组参考序列,使用Corset软件对转录本进行Corset层次聚类分析,获得后续分析用的unigene。使用Diamond Blastx软件基于6大公共数据库(KEGG、NR、Swiss-Prot、GO、KOG、Trembl)并使用Hmmer软件基于Pfam数据库,对各样本中的基因进行比对和功能注释。通过Trans Decoder软件对组装得到的转录本进行CDS预测,再通过RSEM软件进行基因表达定量。使用DESeq2进行样品组间的差异表达分析,获得差异表达基因。基于K-means聚类分析分析基因在居群间表达趋势,运用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行注释和功能富集分析。使用i TAK软件预测转录因子并进行注释。(3)代谢组和转录组整合的质量差异机理分析。基于差异表达基因和代谢物及文献调研对箭叶淫羊藿3个居群叶片黄酮醇类成分生物合成途径进行构建,并对该途径差异表达基因进行聚类分析。对差异表达基因和代谢物进行KEGG通路分析、KEGG富集分析和相关性分析。选取皮尔森相关性系数(Pearson correlation coefficient,r)r>0.80的结果,利用Cytoscape＿v3.10.0对基因-代谢物、代谢物-转录因子相关性网络网络进行可视化分析。结果(1)箭叶淫羊藿代谢组分析。基于广泛靶向代谢组学技术,在箭叶淫羊藿3个居群叶片中共鉴定出1020个代谢物。其中,差异代谢物共573个,黄酮类差异代谢物共228个,为差异代谢物中占比最大的化合物(39.8%)。鉴定的3个花青素类物质中,仅矢车菊素-3,5-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-(2”-O-葡萄糖基)葡萄糖苷含量与朝藿定C含量存在显著相关性(P<0.01),朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿苷含量与花青素类成分含量均没有显著相关性。以AHHS居群为对照组,JXWN和HBLT居群多数黄酮类、酚酸类、其他类和萜类呈上调趋势。证实AHHS居群为箭叶淫羊藿质量机制研究的理想对照居群。对差异代Alisertib细胞培养谢物进行KEGGLEE011配制功能注释和富集分析,3个差异分组差异代谢物均显著富集到黄酮生物合成途径,AHHS vs HBLT和AHHS vs JXWN中差异代谢物均富集显著的通路为黄酮与黄酮醇生物合成途径和黄酮生物合成途径。(2)箭叶淫羊藿转录组分析。基于转录组测序技术,对箭叶淫羊藿3个居群同一营养阶段叶片的9个样本进行转录组分析,总共获得61.32 Gb高质量reads碱基总数,每个样本高质量reads碱基总数6.00 Gb以上。组装后得到179679个表达基因,序列平均长度为869 bp。将unigene与7大数据库(KEGG、NR、Swiss-Prot、Trembl、KOG、GO和Pfam数据库)进行比对和功能注释,共91388个基因(50.86%)至少在一个数据库中被注释。在NR数据库的物种注释表明,Nutrient addition bioassay箭叶淫羊藿与耧斗菜Aquilegia coerulea E.James亲缘性关系较近。对箭叶淫羊藿不同居群叶片的基因进行差异表达分析。AHHS vs HBLT、AHHS vs JXWN和JXWN vs HBLT的差异表达基因总数分别为18569、9657和18784个。其中,AHHS vs HBLT、AHHS vs JXWN和JXWN vs HBLT分别有867、344和842个差异表达基因被注释为转录因子。3个比较分组共有的差异基因为1201个,AHHS vs JXWN中特有差异基因最少,为1643个,AHHS vs HBLT中特有差异基因最多,为3938个。通过KEGG数据库对箭叶淫羊藿3个居群叶片转录组数据进行富集分析,箭叶淫羊藿3个居群表达基因共被注释于140条KEGG代谢通路,3个比较分组中的差异基因均富集的通路为植物昼夜节律通路。(3)代谢组和转录组整合的质量差异机理分析。对代谢组和转录组数据进行整合分析,鉴定出参与黄酮醇类成分生物合成途径中84个差异表达基因编码的8种酶(7个PAL、16个4CL、6个CHS、12个CHI、2个F3H、13个FLS、2个Ao MT和26个GT)和10种代谢物,初步完成箭叶淫羊藿总黄酮醇苷生物合成途径构建。其中,糖基转移酶为合成途径中差异表达数量最多的基因。将生物合成途径图中10个代谢物、总黄酮醇苷(即:朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷)、2”-鼠李糖基淫羊藿次苷-II、淫羊藿次苷II和箭藿苷B与差异基因进行相关性分析,表明56个基因与总黄酮醇苷、2”-鼠李糖基淫羊藿次苷-II、淫羊藿次苷II、箭藿苷B、肉桂酸、对香豆酸、柚皮素查尔酮、柚皮素、二氢山柰酚、山柰酚和淫羊藿素含量具有强相关性(r>0.80)。对170个MYB、MYB-related和b HLH家族转录因子与箭叶淫羊藿生物活性成分及各阶段代谢物进行相关性分析表明,105个MYB、MYB-related和b HLH家族转录因子与总黄酮醇苷、2”-鼠李糖基淫羊藿次苷-II、淫羊藿次苷II、箭藿苷B、肉桂酸、对香豆酸、柚皮素查尔酮、柚皮素、二氢山柰酚、山柰酚、8-异戊烯基山柰酚和淫羊藿素含量具有强相关性(r>0.80)。其中,在NR数据库中,注释为箭叶淫羊藿转录因子的序列Cluster-4340.101633与朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿素积累呈正相关(r>0.80)。结论(1)质量评价研究启示。广泛靶向代谢组学可获取箭叶淫羊藿不同居群更全面的质量评价。3个居群间的差异不仅存在于总黄酮醇苷差异,整体代谢物也存在显著差异,且可稳定遗传。这种差异进一步证实,值得对箭叶淫羊藿质量优势居群HBLT和江西本地优质居群JXWN进行更深入的总黄酮醇苷积累分子机制研究。箭叶淫羊藿3个居群的整体化学成分变异度较大。基于中医药整体观思维,需对淫羊藿不同物种和产地开展更深入细致的药理学和药代动力学研究及临床试验,完善其质量评价体系并指导合理用药。此外,花青素含量与朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿苷含量均不存在显著相关性。结合HBLT居群叶片具有丰富紫红色斑块和花青素含量的特性,化学型为淫羊藿苷主导-朝藿定B强峰类的HBLT居群,可用于选育花青素合成量高且总黄酮醇苷含量适宜品种,提高观赏价值和经济价值,促进中药资源综合利用。(2)质量差异机制启示。在同质园栽培环境因素一致前提下,基因表达仍存在显著差异,证实箭叶淫羊藿不同居群间质量差异可稳定遗传。箭叶淫羊藿尚有大量遗传信息等待解析,具有巨大挖掘潜力。尤其是HBLT居群,本研究筛选出大量差异表达基因,结合代谢组学和酶学表征等数据将有望挖掘功能基因,并解析总黄酮醇苷和淫羊藿素的生物合成,为淫羊藿黄酮醇类活性成分的异源生产提供遗传基础。3个比较分组中的差异基因均富集的通路为植物昼夜节律通路,表明淫羊藿活性成分积累可能与昼夜节律具有密切相关性,后续研究可进一步证实。提示或可通过昼夜节律特征进行品种选育。(3)生物合成途径启示。根据构建的总黄酮醇苷生物合成途径,推测箭叶淫羊藿O-甲基转移酶为S-腺苷-L-蛋氨酸依赖性酶,AHHS居群总黄酮醇苷含量低可能受S-腺苷-L-蛋氨酸含量限制。糖基转移酶在转录组数据中为合成途径中差异表达数量最多的基因,淫羊藿糖基转移酶多样性是淫羊藿黄酮醇苷类成分种类多的重要原因。此外,在NR数据库中注释为箭叶淫羊藿转录因子的序列Cluster-4340.101633与朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿素积累呈正相关(r>0.80),推测其为箭叶淫羊藿活性成分生物合成的候选正调控因子。