缺血性脑卒中是全球第二大死因。因此,探索有效的、新兴的缺血性脑卒中分子靶点是基础和临床研究的首要任务。本研究旨在探讨促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)在缺血性脑卒中的作用及其机制,为缺血性脑卒中的治疗提供参考。分别采用CRF、antalarmin或astressin-2B激活或阻断BV2小胶质细胞和已构建远端大脑中动脉闭塞(d MCAO)模型的成年雄性小鼠的CRF1(CRF受体1)或CRF2(CRF受体2)。我们发现CRF不仅可以通过促进炎症因子的转录和产生增加BV2小胶质细胞的活性,还可以促进激活的BV2小胶质细胞从神经保护表型(M2)向细胞毒性表型(M1)的转化,这些作用可能是通过TLR4/My D88/NF-κB信号通路介导的,更有趣的是此作用可以被antalarmin阻断,但不能被astressin-2B阻断。CRF显著加重了小鼠缺血性脑卒中后的神经功能缺损,增加了梗死体积,加重了神经损伤。此外,CRF显著提高脑缺血半暗带中TNF-α和磷酸化NF-κB的水平。最后,CRF使缺血半暗带中CD16/Iba-1阳性细胞比例显著增加,CD206/Iba-1阳性细胞比例显著减少。这些结果为CRF在缺血性脑卒中的促进炎症作用和可能的机制提供了证据,可能有助于发现缺血性脑卒中的潜在治疗方法。第一部分促肾上腺皮质激素释放因子对小胶质细胞的代谢激活作用目的:检测CRF,antalarmin(CRF1拮抗剂)及astressin-2B(CRF2拮抗剂)对BV2小胶质细胞的毒性作用。检测CRF,antalarmin及astressin-2B对BV2小胶质细胞促炎因子基因转录及产物生成的影响。检测CRF,antalarmin及astressin-2B对BV2小胶质细胞表型分化的影响。方法:BV2小胶质细胞分为6组:(1)空白对照组;(2)CRF(10 nmol/L)组;(3)antalarmin(100 nmol/L)组;(4)astressin-2B(100 nmol/L)组;(5)CRF(10 nmol/L)+antalarmin(100 nmol/L)组;(6)CRF(10 nmol/L)+astressin-2B(100 nmol/L)组。上述各组细胞被干预24小时后,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)测定细胞活力;采用ELISA检测IL-1β和TNF-α的产生;采用q RT-PCR检测促炎因子基因(Il1b,Tnf)以及M1型小胶质细胞标记物基因(Nos2,Ptgs2)和M2a型小胶质细胞标记物基因(Arg1,Mrc1)的表达变化。实验数据采用均数±标准差表示,应用SPSS26.0软件进行统计分析,以P<0.05,表示差异有统计学意义。结果:1 CCK-8:与空白对照组相比,各实验组与对照组均无显著性差异,表明上述各浓度药物干预24小时对BV2小胶质细胞无毒性作用;2 ELISA:与空白对照组相比,CRF组和CRF+astressin-2B组IL-1β和TNF-α的产生显著增加(P<0.01),而CRF+antalarmin组则显著抑制了这些作用;3 q RT-PCR:与空白对照组相比,CRF组和CRF+astressin-2B组Il1b和Tnf m RNA表达显著升高(**P<0.01,*P<0.05),而CRF+antalarmin与空白对照组相比无统计学差异;与空白对照组相比,CRF组Nos2 m RNA表达显著升高(P<0.01),其余各组与空白对照组相比无统计学差异,CRF组和CRF+astressin-2B组Ptgs2 m RNA表达显著升高(P<0.01),其余各组与空白对照组相比无统计学差异;与空白对照组相比,CRF组Arg1 m RNA表达显著降低(P<0.05),其余各组与空白对照组相比无统计学差异,CRF组Mrc1 m RNA表达显著降低(P<0.05),其余各组与空白对照组相比无统计学差异。小结:CRF可以通过作用于CRF1增加BV2小胶质细胞促炎因子的转录和产生,并导致激活的BV2小胶质细胞从神经保护表型(M2型)转化为细胞毒性表型(M1型)。第二部分促肾上腺皮质激素释放因子对小胶质细胞炎症通路的影响目的:探讨促肾上腺皮质激素释放因子对BV2小胶质细胞TLR4/My DFarmed sea bass88/NF-κB炎症通路的影响。方法:BV2小胶质细胞分为6组:(1)空白对照组;(2)CRF(10 nmol/L)组;(3)antalarmin(100 nmol/L)组;(4)astressin-2B(100 nmol/L)组;(5)CRF(10 nmol/L)+antalarmin(100 nmol/L)组;(6)CRF(10 nmol/L)+astressin-2B(100 nmol/L)组。上述各组BV2小胶质细胞被干预24小时后,应用Western-blot对下列指标进行检测:(1)TLR4;(2)My D88;(3)细胞质P-NF-κB;(4)细胞核P-NF-κB。结果:1与空白对照组相比较,CRF组和CRF+astressin-2B组TLR4蛋白水平均显著升高,分别为(P<0.01,P<0.05);2与空白对照组相比较,CRF组和CRF+astressin-2B组My D88蛋白水平均显著升高,分别为(P<0.01,P<0.05);3与空白对照组相比较,CRF组细胞质P-NF-κB蛋白水平显著升高(P<0.01);4与空白对照组相比较,CRF组和CRF+astressin-2B组细胞核P-NF-κB蛋白水平均显著升高,分别为(P<0.01,P<0.05)。小结:促肾上腺皮质激素释放因子作用于BV2小胶质细胞CRF1,激活TLR4更多/My D88/NF-κB炎症信号通路。第三部分促肾上腺皮质激素释放因子通过小胶质细胞炎症激活加重缺血性脑卒中神经细胞损伤目的:利用雄性成年小鼠构建远端大脑中动脉闭塞(d MCAO)模型,采用侧脑室注射的方法,检测CRF、antalarmin或astressin-2B对小鼠缺血性脑卒中模型的神经功能,脑梗死体积以及神经元损伤的影响。此外,应用免疫荧光技术检测脑缺血半暗带中TNF-α和P-NF-κB的水平以及CD16/Iba-1阳性细胞和CD206/Iba-1阳性细胞比例。方法:采用永久性闭塞大脑中动脉(MCA)和颈总动脉(CCA)的方法制造局灶性大脑皮质缺血模型。将雄性成年小鼠右侧CCA给予永久性结扎,右侧远端MCA给予电凝。假手术组小鼠暴露CCA但不给予闭塞,暴露远端MCA但不给予电凝。将小鼠随机分为5组,每组各10只,造模成功后,立即应用侧脑室注射的方法,各组给予以下药物干预:(1)假手术组(Sham);(2)大脑中动脉闭塞组(d MCAO-Con);(3)大脑中动脉闭塞+CRF组(d MCAO-CRF);(4)大脑中动脉闭塞+antalarmin组(d MCAO-antalarmin);(5)大脑中动脉闭塞+astressin-2B组(d MCAO-astressin-2B)。在脑缺血后的第2天,根据实验设计,采用Bederson试验对小鼠进行神经行为缺陷的评估,然后在深度麻醉下将小鼠快速脱位杀死;采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色的方法对脑梗死体积进行测定;应用H&E染色及尼氏染色对缺血半暗带神经元的形态变化进行观察;应用免疫荧光技术检测缺血半暗带Iba-1,TNF-α,P-NF-κB以及CD16/Iba-1阳性细胞和CD206/Iba-1阳性细胞的比例。结果:1与Sham组比较,d MCAO-Con组小鼠神经功能缺陷评分显著升高(P<0.01);与d MCAO-Con组相比,d MCAO-CRF组小鼠的神经功能缺陷评分显著增加(P<0.05),提示神经功能状况更差;d MACO-Con组、d MACO-antalarmin组和d MACO-astressin-2B组小鼠神经功能缺陷评分差异无统计学差异;2与d MCAO-Con组相比,d MCAO-CRF组显著增加了梗死体积(P<0.01);然而,d MAselleck产品CO-antalarmin组则显著降低了梗死体积(P<0.05);3在缺血半暗区,神经细胞H&E染色显示轮廓清晰,结构紧密,核仁完整的细胞定义为H&E染色阳性(H&E~+)的细胞。Sham组和d MCAO-Con组的H&E~+细胞比例分别为86%±4.2%和65%±5.8%,组间差异有统计学意义(P<0.01);与d MCAO-Con组相比较,d MCAO-CRF组H&E~+细胞比例显著较低至51.7%±6.8%,差异有统计学意义(P<0.05)。神经元尼氏染色显示胞质丰富,胞体完整,细胞核致密的细胞定义为尼氏染色阳性(尼氏~+)的细胞。Sham组和d MCAO-Con组的尼氏~+细胞比例分别为84.3%±4.3%和63.3%±4.3%,组间差异有统计学意义(P<0.01);与d MCAO-Con组相比较,d MCAO-CRF组的尼式~+细胞比例显著降低至50%±5.1%,差异有统计学意义(P<0.05);4与d MACO-Con组相比,d MACO-CRF组中Iba-1和TNF-α的表达显著升高,d MCAO-antalarmin组Iba-1和TNF-α水平明显降低;与d MACO-Con组相比,d MCAO-CRF组Iba-1和P-NF-κB的表达明显升高,d MCAO-antalarmin组Iba-1和P-NF-κB的表达则明显降低;5与Sham组相比,d MCAO-Con组CD16/Iba-1阳性细胞比例显著增加(P<0.01),与d MCAO-Con组相比,d MCAO-CRF组的CD16/Iba-1阳性细胞比例显著升高(P<0.01),d MCAO-antalarmin组CD16/Iba-1阳性细胞比例显著减少(P<0.01);与Sham组相比,d MCAO-Con组CD206/Iba-1阳性细胞比例显著增加(P<0.01),然而,与d MCAO-Con组相比,d MACO-CRF组的CD206/Iba-1阳性细胞比例显著减少(P<0.01),而d MCAO-antalarmin组CD206/Iba-1阳性细胞比例显著升高(P<0.01)。小结:CRF明显加重缺血性脑卒中后神经功能的损伤,增加了脑梗死体积并且导致了神经元的损伤,CRF1受体拮抗剂antalarmin可以逆转部分上述影响,在脑缺血后脑损伤中有一定的保护作用。结论:CRF可以通过促进炎症因子的转录和产生来激活BV2小胶质细胞,从而导致活化的BV2细胞从神经保护表型(M2)转化为细胞毒性表型(M1)。CRF通过增加炎性小胶质细胞活化显著加重缺血性卒中损伤,这与促进TLR4/My D88/NF-κB通路和增加M1型神经毒性小胶质细胞活化有关。