目的:建立糖尿病大鼠义齿性口炎模型,研究使用基于PAD~(TM)Plus的光化合技术(Photo-activated disinfection,PAD)治疗糖尿病大鼠义齿性口炎的疗效,为临床治疗义齿性口炎提供实验依据。方法:1、糖尿病大鼠义齿性口炎模型的构建及评估选取2月龄雄性SD大鼠,随机选15只大鼠作为正常组;其余大鼠单次腹腔注射60mg/kg 1%链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)以建立糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型。从糖尿病大鼠中选取60只血糖达标的大鼠,随机分为4组即单纯DM组、DM义齿组、DM接种组和DM接种+义齿组分别15只。正常组不进行任何处理;单纯DM组在上腭涂抹生理盐水;DM义齿组用生理盐水涂抹上腭后结扎无菌义齿;DM接种组不结扎义齿,仅用1×10~9CFU/m L的SC5314白色念珠菌菌液涂抹上腭;DM接种+义齿组用1×10~9CFU/m L的菌悬液涂抹上腭后结扎接种好的义齿。每周对DM接种组和DM接种+义齿组大鼠上腭涂擦一次菌液,其余DM大鼠每周涂擦一次生理盐水直至第6周,每周最后一天行临床表现观察、上腭炎症评分、上腭及义齿真菌载量测定以及组织病理学检查,评估糖尿病大鼠义齿性口炎模型建立情况。2、光动力治疗糖尿病大鼠义齿性口炎建立糖尿病大鼠义齿性口炎模型,选取成模的大鼠36只,随机分为PAD 1组、PAD 2组、制霉菌素(Nystatin,NYS)组和感染组,每组各9只。采用PAD~(TM) Plus对PAD 1组和PAD 2组进行处理。PAD 1组:大鼠上腭及义齿组织面分别用小毛刷涂抹1mg/m L甲苯胺蓝(Toluidine Blue O,TBO)溶液,孵育1min,750m W LED红光照射1min,移动光源重复照射1min确保上腭及义齿表面全部覆盖,1次/天,光照1次,共1天;PAD 2组处理方式与PAD 1组相同,间隔1天光照1次,5天共光照3次;NYS组采用100000IU制霉菌素混悬液连续涂抹大鼠上腭及义齿5天,1次/天;感染组大鼠不做任何处理。各组治疗结束后1d、7d,每组大鼠分别行上腭炎症评分、上腭及义齿真菌载量测定、上腭组织病理学检查、免疫组化法检测IL-17、TNF-α变化,半定量分析IL-17、TNF-α平均光密度值。感染组大鼠在PAD 1组和PAD 2组治疗结束后1d和7d相应时间点进行相同检测。结果:1、糖尿病大鼠义齿性口炎模型的建立及评估1.1正常组大鼠一般状态良好,毛顺滑,行动灵活,体重逐渐上升;其余各组大鼠接种1周后,出现毛松且黄、行动迟缓等情况,各组大鼠体重整体呈下降趋势。经重复测量方差分析,各组间的体重变化差异有统计学意义(P_(组别)<0.001),不同时间下体重变化差异有统计学意义(P_(时间)<0.001),组别与时间存在交互效用(P_(交互)<0.001)。经进一步简单效应分析,在接种后1-6周体重变化差异存在统计学意义(P<0.05),1、2周时,单纯DM组、DM义齿组,DM接种+义齿组体重丧失明显多于正常组和DM接种组(P<0.05);3-6周时,单纯DM组、DM接种组、DM义齿组及DM接种+义齿组体重丧失明显多于正常组(P<0.05)。1-6周内正常组大鼠血糖正常,均低于16.7mmol/L,其余各组DM大鼠血糖均高于16.7mmol/L;经重复测量方差分析,各组间的血糖差异有统计学意义(P_(组别)<0.001),不同时间下血糖差异有统计学意义(P_(时间)<0.01),组别与时间不存在交互效用(P_(交互)>0.05)。在第1-6周每周各组DM大鼠血糖均明显高于正常组大鼠血糖(P<0.05)。1.2接种前各组大鼠上腭均未见明显红肿异常。接种后第2周,DM接种+义齿组大鼠上腭出现点状红斑,随观察时间延长上腭逐渐出现弥漫性红肿,大鼠上腭炎症评分在第2、3周主要为1分,4-6周主要为2分至3分,差异有统计学意义(P<0.05);其余各组大鼠上腭直至第6周均未见明显异常,上腭炎症评分均为0分(未显示)。1.3上腭及义齿真菌载量测定:白色念珠菌接种后1-6周,正常组、单纯DM组、DM义齿组、DM接种组培养基均购买RAD001未长出念珠菌菌落,上腭真菌载量为0(未显示)。DM接种+义齿组的培养基长出个数不等的棕色菌落,经数据分析可知该组大鼠在接种后第1、2周上腭、义齿真菌载量明显低于3-6周每周的上腭、义齿真菌载量(P<0.05),且经两两比较发现第3-6周的上腭、义齿真菌载量差异无统计学意义(P>0.05)。1.4组织病理学检查:HE和PAS染色显示正常组、单纯DM组、DM义齿组、DM接种组大鼠上腭黏膜上皮层完整,基底层正常排列,未见念珠菌菌丝及孢子。DM接种+义齿组大鼠在接种后第1、2周上腭黏膜上皮未见明显异常,可见少量孢子黏附于上皮层,偶见少量菌丝插入角化层;第3周时上腭黏膜上皮层明显增厚,出现乳头状增生,角化层或上皮外见大量菌丝和孢子;第4-6周时上腭黏膜上皮层呈乳头状增生与第3周病理变化无明显差异,仍可见大量菌丝和孢子黏附于角化层。2、PAD对糖尿病大鼠义齿性口炎的疗效观察2.1上腭黏膜炎症评分:治疗后1d,感染组可见明显的上腭红肿迹象,炎症评分主要为2分,PAD 1组、PAD 2组及NYS组上腭炎症有所缓解,未见明显红肿,评分主要为0分至1分;治疗后7d,感染组上腭炎症更加严重,炎症评分主要为2分到3分,PAD 1组可见上腭部分红肿,评分主要为1分到2分,PAD 2组和NYS组上腭未见明显红肿,评分主要为0分到1分。两两比较结果显示治疗后1d时,感染组评分明显高于PAD 1组、PAD 2组和NYS组(P<0.05);7d时感染组评分明显高于PAD 2组(P<0.05)。2.2上腭及义齿真菌载量分析PAD 1组治疗结束后7d上腭及义齿的真菌载量高于治疗后1d(P<0.05);而感染组、光动力2组与NYS组治疗结束后1、7d上腭及义齿真菌载量Blebbistatin说明书差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后1d,各组上腭、义齿真菌载量值具有统计学意义(P<0.05),组间比较显示PAD 1组、PAD 2组及NYS组上腭、义齿真菌载量均低于感染组(P<0.05),PAD 1组、PAD 2组及NYS组上腭、义齿真菌载量差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后7d,各组上腭、义齿真菌载量值具有统计学意义(P<0.05),两两比较显示感染组上腭、义齿真菌载量均高于PAD 2组及NYS组、PAD 1组上腭真菌载量高于PAD 2组及NYS组,PAD 1组义齿真菌载量高于PAD 2组(P<0.05),PAD 1组与感染组、PAD 2组与NYS组间上腭及义齿真菌载量,PAD 1组与NYS组间义齿真菌载量差异无统计学意义(P>0.05)。2.3上腭组织病理学治疗结束后1d、7d,HE和PAS染色显示,感染组上皮层明显增厚,呈乳头状突起,大量菌体黏附于组织表面,上皮浅表可见菌丝侵入。1d时PAD 1组、PAD 2组及NYS组上皮结构比较正常,念珠菌数量明显少于感染组,偶见少量菌体黏附于黏膜表面,未见菌丝侵入,各治疗组间差异不明显。7d时PAD 1组上皮可见部分增生,大量菌体黏附于黏膜表面,部分菌丝侵入上皮,但少于感染组;PAD2组及NYS组上皮结构比较正常,偶见少量菌体黏附于黏膜表面,少量菌丝侵入上皮浅层。2.4 PAD对糖尿病义齿性口炎大鼠上腭黏膜中IL-17及TNF-α表达水平的影响IL-17为分泌型蛋白,上皮各层细胞胞质、细胞间质均可见棕黄色表达;TNF-α主要表达在上皮层全层的细胞胞浆,胞浆可见棕黄色染色。治疗后两种因子在感染组均可见上皮各层细胞和血管内皮细胞中呈强阳性表达。IL-17因子在治疗后1d,PAD 1组、PAD 2组及NYS组上皮各层细胞、间质和血管内皮细胞胞质中弱阳性表达,染色较感染组浅。治疗后7d感染组和PAD 1组主要在上皮各层细胞、间质和血管内皮细胞中呈强阳性表达;PAD 2组及NYS组主要在上皮各层细胞、间质和血管内皮细胞胞质中呈弱阳性表达,染色较thermal disinfection感染组和PAD 1组浅。两两比较分析显示:治疗后1d时,感染组平均光密度值显著高于PAD 1组、PAD 2组和NYS组(P<0.05);PAD 1组平均光密度值也稍高于PAD 2组和NYS组(P<0.05);PAD 2组和NYS组间差异无统计学意义(P>0.05);7d时,感染组和PAD1组平均光密度值显著高于PAD 2组和NYS组(P<0.05);感染组和PAD 1组、PAD 2组和NYS组间差异无统计学意义(P>0.05)。TNF-α因子在治疗后1d,PAD 1组、PAD 2组及NYS组主要在上皮各层细胞和血管内皮细胞胞质中呈弱阳性表达,染色较感染组浅;治疗后7d,PAD 1组在上皮表层、基底层和血管内皮细胞呈强阳性表达,粒层、棘层中呈阳性表达;PAD 2组及NYS组主要在上皮各层细胞和血管内皮细胞胞质中呈弱阳性表达,染色较感染组和PAD 1组浅。两两比较分析显示:治疗后1d时,感染组平均光密度值显著高于PAD 1组、PAD 2组和NYS组(P<0.05);PAD 1组、PAD 2组和NYS组间差异无统计学意义(P>0.05);治疗后7d时,感染组和PAD 1组的平均光密度值明显高于PAD 2组及NYS组(P<0.05);感染组和PAD 1组、PAD 2组和NYS组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.糖尿病大鼠口腔接种白色念珠菌菌液后3周,成功建立了糖尿病大鼠义齿性口炎模型,在接种后第3-6周模型具有稳定性。2.基于PAD~(TM) Plus的光化合技术能显著降低糖尿病DS大鼠上腭及义齿的真菌载量,明显改善上腭炎症症状;降低糖尿病伴DS大鼠上腭组织中IL-17和TNF-α的表达。3.采用1mg/m L TBO溶液,孵育1min,输出功率750m W LED光源光照1min,间隔1天光照1次,共光照3次的治疗方式相对光照1次具有更好的治疗效果;与NYS的治疗效果相似。