嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T细胞)治疗是过继性免疫治疗的典型代表,近年来得到迅猛发展。简言之,它是从患者体内分离出健康T细胞,通过电转法、慢病毒、腺病毒等转染手段将经基因工程技术构建的CAR基因导入细胞内培养表达,最终将构建得到CAR-T细胞回输患者体内,实现对肿瘤细胞的靶向性杀伤。CAR基因主要元件包括单链抗体可变区Sc Fv、胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区。CAR的成功表达赋予T细胞识别肿瘤细胞并迅速活化杀伤肿瘤细胞的能力,同时又绕过了MHC限制性。CAR-T细胞治疗因靶向性强,目前已有多款产品上市。但是,CAR-T细胞治疗也伴随着严重的不良反应,主要包括脱靶效应和细胞因子风暴。研究者针对CAR-T治疗的不良反应提出了多种应对策略,如在CAR-T细胞内引入自杀基因,当细胞因子分泌过度时,自杀基因可以诱导CAR-T细胞凋亡;考虑到自杀基因会中断昂贵的治疗过程,研究者提出了构建On-switch CAR-T细胞的设想,即将传统CAR基因分两段构建并在细胞内单独表达,如在多肽上设计表达FKBP、FRB蛋白结构域,在二聚化小分子药物如雷帕霉素或其衍生物AP21967链接作用下,两段CAR结合,完善T细胞激活信号通路,才能产生免疫作用。通过调控二聚化小分子药物的释放和分布可以实现On-switch CAR-T的“开-关”,减少不必要的副作用。脂质体是一款经典的纳米药物载体,因其具有增加药物溶解度,生物相容性好等诸多优点在临床上得到广泛应用。特别是因为高通透强滞留效应(EPR)的存在,使脂质体在肿瘤治疗领域具有重要地位。ROS响应型脂质体是基于肿瘤微环境中ROS高水平表达制备而成的刺激响应型载体,以期运载药物在肿瘤部位精准释放。研究者们进一步将光动力治疗与ROS响应型脂质体相结合,开发了光敏ROS响应型脂质体,应对肿瘤微环境下ROS表达的不确定性。光敏ROS响应型脂质体可将光敏剂和药物一起载入脂质体内,当到达目标部位后,外界给予光照,光敏剂生成ROS(单态氧~1O_2)破坏脂质体的稳定性,促使包载药物释放。本课题构建靶向间皮素的On-switch CAR-T细胞,在课题组前期光敏脂质体研究基础上制备共载光敏剂八丁氧基酞菁钯Pd PC(OBU)_8和二聚化小分子药物雷帕霉素或AP21967的光敏ROS脂质体,将其导入On-switch CAR-T细胞中。On-switch CAR-T细胞携载光敏ROS脂质体一起到达肿瘤部位,外部近红外光照射和肿瘤部位高ROS使光敏ROS脂质体中二聚化小分子药物释放,远程激活肿瘤部位On-switch CAR-T细胞免疫应答,精确控制On-switch CAR-T细胞的活性水平,避免CAR-T细胞引起的副作用。本课题考察了所构建的新型On-switch CAR-T细胞对于高表达间皮素的卵巢癌的体内外抗肿瘤National Biomechanics Day作用。首先构建了传统靶向间皮素的CAR-T细胞,验证CAR-T细胞对卵巢癌的体外作用。将构建的第二代CAR基因转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经提取后获取目标质粒,用慢病毒对其包载。再将慢病毒转染经磁珠分选活化的人T细胞,扩大培养获取meso CAR-T细胞。流式细胞术检测CAR基因表达率在70%以上,Western blot验证CAR蛋白表达,结果可见清晰目的蛋白条带。LDH释放检测法验证meso CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用,结果显示:(1)meso CAR-T细胞对间皮素高表达卵巢癌OVCAR-3细胞具有更高的杀伤效能,且优于未转染T细胞;(2)meso CAR-T细胞对OVCAR-3细胞的杀伤效能随反应时间延长而增强,24h后可实现完全杀伤;(3)meso CAR-T细胞对OVCAR-3细胞的杀伤效能随效靶比增大而增强。ELISA检测与OVCAR-3细胞反应后细胞因子TNF-α、IL-2的分泌水平,meso CAR-T细胞组均高于未转染T细胞组,表明meso CAR-T细胞具有更高的免疫活性。其次,构建了靶向间皮素的On-switch CAR-T细胞,倒置显微镜下可见CAR蛋白链表达后的红色荧光。流式检测流式细胞术检测CAR基因表达率在90%以上,Western blot验证CAR蛋白表达,结果可见清晰蛋白条带。LDH释放检测法验证On-switch CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用,在小分子药物雷帕霉素、AP21967的二聚化作用介导下,On-switch CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤效能随小分子浓度的提升而增强。ELISA检测与OVCAR-3细胞反应后细胞因子TNF-α、IL-2的分泌水平,On-switch CAR-T细胞组均高于未转染T细胞组,表明On-switch CAR-T细胞具有更高的免疫活性。再次,建立了检测小分子药物雷帕霉素、AP21967及光敏剂Pd PC(OBU)_8含量的方法。采用反相高效液相色谱法测定雷帕霉素以及AP21967的含量,紫外-可见光分光光度法测定Pd PC(OBU)_8的含量。分别考察其专属性、线性范围、精密度和准确度。雷帕霉素在0.2～40μg·ml~(-1)浓度范围内线性良好,线性回归方程为A=0.6240C-0.1738,R2=0.9990,精密度、准确度良好。AP21967在0.25μM～10μM浓度范围内线性良好,回归方程为A=0.2016C-0.0119,R2=0.9968,精确度、准确度良好。Pd PC(OBU)_8在2～12μg·ml~(-1)浓度范围内线性良好,回归方程为A=0.0665C+0.0022,R2=0.9999。以DSPC、18:2(Cis)PC(DLPC)、胆固醇、DSPE-m PEG_(2000)为膜材,以Pd PC(OBU)_8为光敏剂,制备分别包载雷帕霉素或AP21967的ROS响应脂质体。DLPC为不饱和磷脂,其中碳碳双键结构可被ROS氧化改变,促使小分子药物释放。采用RAD001纯度单因素法分别考察DLPC、胆固醇、DSPE-m PEG_(2000)、Pd PC(OBU)_8用量对脂质体各指标的影响。确定了最优的处方条件,即DSPC、DLPC、胆固醇、DSPE-m PEG_(2000)用量摩尔比为60:10:25:5,Pd PC(OBU)_8投药质量比为1:100。优选处方所制备的脂质体粒径为141.7±1.Smoothened Agonist研究购买5nm,PDI值为0.036±0.001,Zeta电位为-12.8±0.6 m V;Rapamycin的包封率为(98.43±0.47)%,载药量为(1.15±0.01)%。6h药物累积释放率达到60%以上。4℃低温环境中,脂质体7日内粒径稳定在110～120nm,PDI保持在0.2以下,表明脂质体稳定性良好。48h内,脂质体在20%乙醇溶液和含血清培养基中结构稳定。最后制备了携载光敏ROS响应脂质体的On-switch CAR-T细胞,考察其体外抗肿瘤作用。实验证明,脂质体、近红外光对On-switch CAR-T细胞、靶细胞OVCAR-3细胞无毒性。在经红外光照射后,携载光敏ROS响应脂质体的On-switch CAR-T细胞对间皮素高表达卵巢癌细胞OVCAR-3具有特异性杀伤作用。对比同水平药物浓度下(200n M)两种光敏ROS脂质体对On-switch CAR-T细胞免疫功能的影响,结果无差异,为后续体内实验奠定工作基础。