人类平衡型核苷转运体(hENT1)是人类细胞中最丰富和分布最广泛的质膜核苷转运体,负责介导大量的核苷和核苷类似物在细胞内外之间的转运。随着核苷类似物药物在癌症治疗过程中所占比重的增大,hENT1在许多疾病的治疗中都Vorinostat体内具有极大的应用潜力。研究hENT1的表达与功能对此类药物疗效的影响就显得尤为重要。然而传统的成像和标记方法并不能在单分子水平上研究hENT1在细胞膜上的定位、组装以及功能特性。为更直观、高清地准确观察hENT1在细胞膜上的定位和组装,我们制备了更有利于高质量超分辨荧光成像的化学小分子荧光探针,利用直接随机光学重构显微镜(d STORM)获得了hENT1的纳米级分辨率的高清成像,对多种细胞表面和不同处理条件下的hENT1的组装形态进行了系统探究,取得主要研究结果如下:1.我们制备了针对hENT1的具有特异性识别能力的抑制剂型化学小分子荧光探针SAENTA-probe。通过抗体和小分子双色标记以及地拉卓取代实验,我们验证了该合成探针的标记特异性;通过和hENT1传统抗体探针标记获得的d STORM成像对比,我们发现所合成小分子探针因其极小体积和单一结合位点,能够获得更高的标记密度(970±130个点/μm~2)和标记准确度(17.94±7.49 nm),这有利于hENT1膜组装形态的高质量准确成像观察。2.基于小分子标记的d STORM揭示hENT1的组装细节。通过对比观察MDA-MB-231细胞的顶端膜和基底膜上的hENT1分布,我们发现虽然不同表面hENT1都倾向于成簇分布,但在顶端膜上hENT1点密度和簇面积比基底膜分别高23.75%和25.86%,且成簇性更强。我们推测,暴露在培养体系中的细胞顶端膜上hENT1更多地负责了核苷转运工作,更大更紧实的hENT1蛋白簇很可能是其功能蛋白区,更有利于其转运能力地高效实现。我们进一步通过对比糖基化链、脂筏和上皮黏附因子(Ep CAM)对hENT1组装形态的影响差异,揭示不同表面hENT1组装潜在机制的差异,发现糖基化链和脂筏与顶端膜hENT1的组装关系更密切,而Ep CAM与基底膜hENT1的关系更紧密。3.揭示与细胞功能状态相关的hENT1的特异性分布规律。通过对比观察正常细胞和癌细胞上hENT1的分布细节,我们发现由于癌细胞的核苷需求差异,除了在细胞表面的分布含量差异,在hENT1在组装细节上也存在显著差异;值得注意的是,即使同一组织来源的癌细胞,处于不同进展时期,其表面hENT1的分布变化规律也是不同的。我们进一步观察了细胞正常生理状态改变时,hENT1的分布变化情况,发现环境饥饿(无糖无血清)和药物饥饿(C2神经酰胺,C2-Cer)下细胞膜hENT1的分布分别降低了60.72%和72.98%,我们推测当细胞停止分裂或细胞活性受到伤害时,对遗传物质的合成需求降低,会减缓对核苷物质的转运,从而细胞表面hENT1分布含量和成簇趋势都发生了减少,这再次表明,hENT1的分布形态和其功能是有对应关系的,并且不同生理、病理状态下的hENT1Erdafitinib溶解度特异性组装可以作为揭示其细胞状态的潜在信息。4.揭示hENT1组装形态与药物作用效力的潜在关系。基于hENT1可以作为核苷类似物药物的转体,调节药物的吸收,最终影响药物的药效,我们进一步探究了hENT1的组装变化与核苷类药物药效之间的潜在对应关系。我们分别对比了吉西他滨(Gemplasmid biology)和5-氟尿嘧啶(5-FU)对MDA-MB-231和MCF-7细胞的影响,发现受Gem作用更强烈的MDA-MB-231上hENT下降了66%,下降得更加明显;而受5-FU作用更强烈的MCF-7细胞,其表面hENT1升高了151%,且成簇分布现象却随着5-FU作用增强而增加。参照不同药物对不同细胞的作用特点,我们针对两种细胞给出了相应的联合用药的方案,结果表明Gem+C2-Cer组合对MDA-MB-231效果更好,相较于Gem单一用药下降了69%,而5-FU和Gem对MCF-7先后孵育效果更好,相较于Gem单一用药下降了34%。我们首次利用了小分子标记的d STORM成像技术对hENT1的组装形态进行研究,并揭示了hENT1在不同膜表面的一系列组装细节。我们观察到了hENT1的组装形态与细胞生存生活状态的关系,并将这种规律利用到对药效的观察中,根据hENT1组装形态的变化,我们分别得出了针对两种细胞的联合用药方式,这对未来此类药物治疗癌症有启示作用。