甘蓝型油菜(Brassica napus)是全球重要油料作物之一。长江流域是我国油菜的主产区,目前晚稻茬口矛盾问题突出,亟须选育早熟高产品种应用于迟播油菜生产。同时,一直以来在油菜中适时开花和理想分枝是两个重要遗传改良目标。SPL (SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是一类植物特有的转录因子,已有研究表明SPL基因家族成员参与植物生长发育寻找更多的各个阶段,如调节植株形态建成、营养生长向生殖生长的转变、次生代谢、激素信号传递、光信号感知和非生物胁迫响应。同时,在拟南芥和水稻中已报道了部分SPL转录因子影响分枝和产量,而在油菜中有关其研究较少。本研究中,我们以甘蓝型油菜SPL基因家族全部成员作为CRISPR/Cas9系统的靶基因,利用多载体混合文库转化体系结合高通量测序技术,建立了一套甘蓝型油菜突变体创制和筛选方法和技术流程。结果显示,通过CRISPR混合文库高通量测序技术共获得258株甘蓝型油菜转基因阳性植株,其单载体插入的编辑效率为50.31%,多载体插入的编辑效率为36.63%(n=2-7),并鉴定到早花和多分枝数的甘蓝型油菜突变体。在SPL突变体库中分离IACS-010759纯度了BnaA06.SPL4的单突变体和BnaA06.SPL14,BnaC05.SPL14的双突变体并进行田间表型考察。研究发现,较野生型品种bnaspl4~(CR)和bnaspl14~(CR)突变体的开花期提前4-6天,而bnaspl14~(CR)突变体的一次有效分枝数增加7-9个。结果表明BnaSPL4和BnaSPL14可能参与开花调控,BnaSPL14可能参与分枝调控。另一方面,bnaspl4~(CR)spl14~(CR)三突变体较野生型品种表现出开花期提前5-7天,一次分枝增加7-10个,并且产量显著提高50.8%-60.9%。RNAseq分析结果发现,差异表达基因GO富集结果表明,在bnaspl4~(CR)和bnaspl4~(CR)spl14~(CR)突变体中,昼夜节律、开花及光周期相关途径基因被显著富集,而与芽的形成和发育相关的差异基因在bnaspl14~(CR)和bnaspl4~(CR)spl14~(CR)突变体中被显著富集。采用q RT-PCR和Dual-Luc实验验证,结果表明BnaSPL4能够抑制SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1)和PRR7 (PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7)的表达,而BnaSPL14能够抑制MAX1 (MORE AXILLARY GROWTH1)的表达。因此,BnaSPL4是调节开花和昼夜节律的转录抑制因子,而BnaSPL14是调节分枝相关基因的转录抑制因子。综上所述,本研究为油菜的功能基因组研bio-active surface究和遗传改良提供了宝贵的种质资源和策略。