研究背景:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘为主要病理改变的慢性自身免疫性疾病,在临床上缺乏有效的治疗手段。自身免疫性疾病是由机体错误识别自身抗原所导致的免疫系统失衡导致的免疫反应。自身反应性效应CD4+T细胞是介导自身免疫性疾病的主要致病细胞。而具有抑制免疫反应的调节性T细胞(regulatory t cells,Treg)则在介导免疫耐受的过程中发挥作用,可有效地减轻自身免疫性疾病的发病及进展。因此在体外扩增Treg细胞并回输回体内已经成为研究者们目前治疗此类疾病的热点,然而,在体外扩增Treg存在效率低、周期Erdafitinib半抑制浓度长、细胞Pidnarulex抑制剂功能及稳定性差等局限性。因此,如何有效地在体内条件下诱导Treg扩增也成为提高自身免疫性疾病疗效的关键。DCs细胞作为体内功能最强大的一群专职抗原提呈细胞,在自身免疫性疾病的发病及进展过程中起到至关重要的作用。DCs可诱导原始CD4+T细胞分化为自身反应性T细胞,而耐受性DCs作为一种特殊类型的DCs可诱导Treg增殖,并抑制效应性T细胞功能及增殖。VD3(1α,25-hydroxyvitaminD3)是维生素D的活性形式,其作为一种免疫调节剂,可以通过调节DCs共刺激信号水平,从而诱导DCs向耐受性表型分化,从而进一步诱导Treg增殖。Lkb1是细胞代谢和生长的中枢调节因子,Lkb1缺失会导致外周树突状细胞的糖酵解水平升高,免疫原性增强,但这种具有增强成熟能力的表型也允许DCs在稳态条件下增加胸腺Treg的功能和扩增。两种不同机制的治疗方法均可影响DCs细胞的状态,但如何同时实现对DCs共刺激信号及代谢水平的调控,从而诱导Treg增殖,进而介导免疫耐受,成为了本课题要解决的问题。RNA干扰(RNA interfere,RNAi)为靶向调控目的基因的表达提供了解决的方案,但由于核酸本身在递送过程中存在诸多局限,故生物可降解聚合物纳米药物颗粒可作为向免疫系统传递信号的一个多功能的平台。其可以搭载多种药物,同时可以很容易地进行表面修饰,以靶向特定的受体,并被设计成以精确、持续的方式释放封装的药物,从而延长药物半衰期。并具有提高药物溶解度、降低毒副作用、协同药物穿透生物屏障等功能。研究目的:应用纳米药物技术及RNA干扰技术开发一种同时携载免疫调节剂VD3和Lkb1-siRNA的纳米药物颗粒并递送到DCs中,调节树突状细胞表型分化,同时实现Treg扩增的目的,并采用实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE),观察纳米药物颗粒对此类疾病的治疗作用并探讨作用机制。研究方法:(1)合成包载VD3和Lkb1-siRNA的纳米药物颗粒NPs/VD3/siLkb 1;(2)采用实时定量PCR检测纳米药物颗粒对树突状细胞中Lkb1表达的影响;(3)采用流式细胞术(FCM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察检测树突状细胞对于纳米药物颗粒的内吞作用;(4)采用小动物活体成像仪、激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测通过腹股沟皮内注射,纳米药物颗粒在小鼠活体内及组织内的分布情况;(5)采用流式细胞术检测纳米药物颗粒对BMDC表型分化的影响情况;(6)采用流式细胞术检测腹股沟皮内注射纳米药物颗粒对正常C57BL/6J小鼠引流淋巴结中树突状细胞表型及Treg细胞增殖的影响;(7)用完全弗氏佐剂加MOG35-55抗原多肽混合乳液,给小鼠背部皮下注射,百日咳毒素腹腔注射构建EAE模型;(8)观察腹股沟区皮内注射纳米药物颗粒对EAE小鼠发病情况的影响,采用流式细胞术检测小鼠引流淋巴结内DCs表型变化,采用H&E染色、LFB染色观察小鼠脊髓内炎症细胞浸润情况及脱髓鞘变化。结果:(1)成功制备同时包载VD3和Lkb1-siRNA的纳米药Live Cell Imaging物颗粒,并可下调树突状细胞中Lkb1的表达;(2)纳米药物颗粒在体外可将药物递送入DCs内,在体内可以在引流淋巴结内富集,并被DCs吞噬;(3)NPs/VD3/siLkb1纳米药物颗粒可影响BMDC表型变化;(4)NPs/VD3/siLkb1纳米药物颗粒可对正常小鼠引流淋巴结中DCs表型产生影响,并使Treg细胞增殖;(5)完全弗氏佐剂和MOG35-55抗原肽乳液皮下注射,PTX腹腔注射能够有效诱导EAE模型;(6)NPs/VD3/siLkb1纳米药物颗粒可推迟EAE小鼠发病时间及减轻发病程度,并减轻脊髓内的炎症细胞浸润和脱髓鞘改变。结论:本研究成功制备了联合包载VD3及Lkb1-siRNA的纳米药物颗粒。该颗粒能被引流淋巴结中的树突状细胞吞噬,并将疏水性及亲水性药物递送至胞浆内,于细胞基质中发挥作用。NPs/VD3/siLkb1可有效诱导并维持树突状细胞向耐受性表型分化,并可一定程度上提高调节性T细胞的水平。VD3及Lkb1-siRNA的联合给药可推迟实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠的发病,且降低发病程度,同时减轻脊髓内炎症浸润及脱髓鞘改变,其机制可能同通过诱导维持淋巴结内树突状细胞向耐受性表型分化相关。