由于肿瘤免疫疗法有着独特的激发或调动机体免疫应答的能力,在癌症治疗领域展示出了极佳的效果,因此受到日益热切的关注。免疫疗法此网站的关键在于增强肿瘤的免疫原性,提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别能力。免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death,ICD)可以通过增强内源性抗原的分泌来提高肿瘤的免疫原性,促进抗原呈递细胞(Antigen presenting cell,APC)的成熟,激活细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,CTLs),介导抗肿瘤免疫应答。自噬(Autophagy)是一种细胞自我吞噬的现象,是细胞本身就有的代谢过程,在肿瘤治疗过程中展示出了独特的“双刃剑”效果。轻度的自噬会保护肿瘤细胞,抵抗外界对肿瘤细胞的损伤;但当自噬的水平超过临界点时,剧烈的自噬将失去细胞保护功能,反而会导致肿瘤细胞发生自噬性细胞死亡(Autophagic cell death,ACD),抑制肿瘤生长。自噬与ICD之间有着紧密的联系,临床常用的化疗药物表柔比星(Epirubicin,EPI)除能杀伤肿瘤细胞外,还可以通过诱导肿瘤细胞发生自噬进而引发ICD效应,且自噬水平与ICD效果呈现正相关。但EPI只能诱导低水平的保护性自噬,这不仅会降低化疗效果,且ICD介导的免疫应答效果也难以满足治疗需要。基于此,本论文设计了一种新型抗肿瘤载药系统,通过加入自噬诱导剂来增强EPI的自噬诱导效果并触发ACD,达到突破保护性自噬且增强ICD效果的双重目的,发挥更好的抗肿瘤效果。载药系统以透明质酸(Hyaluronic acid,HA)为主体,通过含有二硫键的胱胺分别连接精氨酸(Arginine,Arg)、聚乙二醇-聚己内酯(Polyethyleneglycol-polycaprolactone,PEG-PCL)和EPI,制备具有肿瘤主动靶向、增强细胞摄取和还原响应三重功能的聚合物前药(Arg-HA-PEG-PCL/EPI,AHPPE),包载自噬诱导剂STF-62247(STF)来制备STF@AHPPE聚合物纳米粒子。HA外壳既可以防止血清蛋白吸附从而降低溶血毒性,又可以与肿瘤细胞表面高表达的CD44受体结合起到主动靶向的作用。到达肿瘤部位后,Arg可协助载体进入肿瘤细胞,促进载体有效内化及药物积累。胞内高浓度的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)促使二硫键发生断裂,引起纳米粒子崩解并同时释放出EPI和二级纳米粒STF@PP。EPI诱导轻度自噬并引发一定程度的ICD。STF@PP二级纳米粒随后会逐渐释放STF,提升自噬水平并引发ACD,增强ICD效果并引发更高效率的免疫治疗效果。通过核磁共振氢谱(Nuclear mangnetic resonance,~1H-NMR)和凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatography,GPC)对聚合物载体材料的中间产物和最终产物进行表征,确认目标分子的化学结构、组成及分子量等,计算胱胺、Arg、PEG-PCL和EPI的接枝率,最终证明目标聚合物AHPPE的成功合成。利用透析法制备了STF@AHPPE载药纳米粒子,使用动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)、透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)、紫外可见分光光度计(Ultraviolet–visible pectrophotometer,UV-Vis)等对其进行表征,测得粒径为175.20±1.10 nm,Zeta电位为-14.90±0.20 m V;TEM下的形态呈类球形,大小均匀;STF的载药量为2.75%±0.01%。纳米粒子具有良好的稳定性、还原敏感性和释药性能;溶血性实验进一步证明其具有良好的生物相容性。体外实验中,MTT法测得AHPPE和STF@AHPPE对小鼠结肠癌细胞CT26的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))值分别为1.89μg/m L和0.08μg/m L,证明自噬诱导剂的加入能显著增强前药纳米粒的抗肿瘤效果。流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)、激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)和免疫印迹实验(Western blot,WB)结果表明随孵育时间的延长,细胞摄取量增加,且STF@AHPPInfection transmissionE可触发ACD并显著提升ICD效应。体内实验中,建立了小鼠皮下异位肿瘤模型,活体成像结果表明STF@AHPPE在肿瘤部位有效富集selleck MLN4924,具有较好的肿瘤靶向能力。苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色结果证明其具有良好的生物安全性;同时肿瘤切片的H&E染色、TUNEL及Ki67等免疫组化实验结果表明,STF@AHPPE具有最优异的诱导自噬、引发ICD、促进肿瘤凋亡和抑制肿瘤生长的能力。FCM和酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验结果进一步表明STF@AHPPE可显著激发小鼠机体免疫应答。综上所述,本课题成功构建了一种新型的抗肿瘤载药系统STF@AHPPE,集主动靶向、还原响应、自噬级联放大等多种功能于一体,为增强肿瘤免疫治疗提供了新的思路和方法。