地黄,玄参科地黄属多年生草本植物,是我国传统的大宗药材,最早出典于《神农本草经》被列为上品,其根部具有极高的药用价值。然而地黄栽培存在着严重的连作障碍问题,同一块土地种植一年后,需间隔8-10年才能在同一块土地上再次种植,并且连作地黄植株弱小,叶片稀少,根部膨大受到抑制,药用品质下降,经济价值降低,从而严重影响地黄的产业发展。因此探究地黄的连作障碍机制,解决地黄连作障碍问题对地黄产业可持续发展具有重要意义。植物组织培养经过脱分化,再分化的过程可以引发再生植株产生遗传和表观遗传变异。本论文基于组织培养诱变,通过连作胁迫筛选获得具有连作障碍抗性的地黄组织培养再生植株,进一步对突变株的抗氧化能力分析,结合转录组及糖代谢组分析,初步明确地黄连作障碍分子机制。本论文取得如下研究结果:1.以地黄成熟叶片为外植体进行愈伤组织诱导及分化,获得地黄组培再生苗;移栽再生苗至土壤中,对移栽后15天组培苗进行连作浸提液胁迫处理,每周1次,连续处理6次。至移栽后150天,对再生苗地上、地下部生物量测定,获得连作障碍抗性地黄植株。2.对筛选获得的连作抗性及常规(敏感)型再生地黄进行无性繁殖,待地黄块根发芽15天后,使用相同方法进行连作胁迫处理。培养至150天后,选取具有稳定表型的连作抗性再生苗植株(RCR)和常规连作敏感型再生苗植株(RCS)各3株,以及未处理对照组地黄再生苗(RW)3株。通过对RW、RCR和RCS的生物量检测证实,RCR具备显著的耐受连作胁迫的特性。连作胁迫导致地黄烂根现象与根部抗氧化损伤直接相关,本论文分别对RW、RCR和RCS进行ROS相关生理检测,进一步证明经过连作胁迫处理后,会导致地黄ROS水平升高,但RCR中ROS积累明显低于RCS中ROS水平,证实RCR抵抗连作胁迫与ROS水平降低紧密相关。3.为进一步探究地黄RCR产生连作障碍抗性的分子机制,本研究分别采集了RW、RCR、RCS生长至150天的块根进行RNA-seq测序分析,结果显示RCR-vs-RW,RCS-vBYL719纯度s-RW,RCS-vs-RCR的差异基因数量分别为:2966、8604、9811。对以上差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析时发现,差异基因参与了植物-病原体相互作用、植物激素信号转导、鞘脂代谢、甘油脂代谢、谷胱甘肽代谢、糖酵解以及淀粉和蔗糖代谢等代谢途径的调控过程,其中糖类物质代谢相关途径呈现显著富集。4.为进一步明确RCR连作抗性是否与糖类物质代谢相关,本研究采集了连作处理后培养了150天的RW、RCR、RCS的块根进行糖类物质代谢组检测。实验结果显示,24种目标糖类中只有9种糖含量高于0.1mg/g,分别是1,5-酐-D-山梨糖醇(1-5-Anh),D-果糖(Fru),D-半乳糖(Gal),葡萄糖(Glu),肌醇(Inositol),棉子糖(Raffinose),D-核糖-5-磷酸钡盐(Ribose-5-pho-Ba),蔗糖(Suc),海藻糖(Tre)。其中,1,5-酐-D-山梨糖醇,D-果糖,D-核糖-5-磷酸钡盐3种糖含量在RW、RCR和RCS中没有明显变化;但与RW相比,在RCR和RCS中肌醇、棉子糖和蔗糖含量都出现轻微的上调;与RW相比,在RCR和D-Lin-MC3-DMA体外RCS中D-半乳糖和海藻糖含量都出现轻微下调;值得注意的是,与RW相比,其中葡萄糖的含量,在RCR中出现明显下composite hepatic events降,在RCS中没有明显变化,表明连作处理后连作抗性地黄葡萄糖含量降低与其抗性有关。5.为综合分析生理检测,转录组测序以及糖类代谢组检测结果,我们利用q RT-PCR对相关基因行了相对定量检测。结果证实,ROS清除相关的基因在RCR中上调表达,在RCS中下调表达,这与生理检测结果中RCR中ROS积累少于RCS的结果相一致;葡萄糖含量下降可能造成NADPH积累,RCR中NADPH合成相关基因表达显著上调证实了这一结果,同时,抗坏血酸-谷胱甘肽循环(ASA-GSH)相关基因表达上调及酶活性上调,进一步证实糖代谢改变引发的NADPH及抗坏血酸-谷胱甘肽循环相关酶的积累可能提升了RCR植株中ROS的清除能力,以此增强其连作障碍的耐受性。基于转录组分析及定量检测发现,RCR中脂类代谢趋向于二酰甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)减少,三酰甘油(TAG)积累的方向,同样利于ROS的代谢,有利于提高RCR对连作胁迫的抗性。综上所述,本论文通过对连作障碍抗性组培变异株分析,发现组织培养引发地黄RCR株系广泛的基因表达变化,其中以葡萄糖为核心的糖类物质代谢发生显著变化,糖代谢和抗坏血酸-谷胱甘肽循环的改变,促进了NADPH合成,进而增强抗坏血酸-谷胱甘肽循环以此来提升植株ROS的清除能力,降低ROS的积累。此外,以DAG、FFA减少,TAG积累为变异趋势的脂类物质改变对地黄抗连作障碍抗性提升也发挥调节作用。本研究的相关结果为地黄栽培方法的优化及地黄抗连作障碍优良种质资源的创制提供了新的理论依据。