【背景】创伤指由机械性因素造成的组织结构破坏或功能障碍,进而引发一系列病理事件,如:炎症、血管破坏和细胞丢失等。组织愈合或损伤修复速度与程度取决于组织的类型和损伤程度,而对于一些特殊的组织,特别是再生能力有限的组织,很难通过自我修复能力进行损伤修复,如创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)。TBI可在数分钟至数小时内引起脑出血、颅内压升高、神经兴奋性毒、炎症等一系列级联反应。对于TBI后复杂的病理改变,开发一种广泛保护多种神经损伤类型的药物至关重要。然而,目前临床上还没有抑制脑损伤或促进脑修复的有效药物。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由于其强大的旁分泌功能,为包括TBI在内的复杂组织损伤的保护和修复提供了一种潜在的治疗策略。大量研究已证实MSCs可分泌多种损伤修复因子,如血管生成因子VEGF和b FGF,抗炎因子IL-10和TSG-6,神经保护因子G-CSF等。因此,在过去的十几年里,MSCs及其衍生物被广泛研究,应用于组织损伤修复。但常规培养的MSCs旁分泌功能非常有限,部分因子分泌水平低,一些重要细胞因子甚至无法分泌。因此,激活MSCs旁分泌功能,增强其治疗潜能在干细胞治疗领域具有重要意义,近年来受到广泛关注。在之前报道的各种调控MSCs的方法中,临床和实验室研究都发现,3D微球培养是最有效的调控MSCs旁分泌功能的方式。目前,悬滴培养(Hanging drop,HD)仍然是无支架3D MSC微球培养最经典的方法。然而,该方法操作复杂,微球收获率低,严重阻碍了其临床应用。为解决上述问题,在本实验中以向日葵盘状花轴的结构为灵感,设计并3D打印制作了微腔阵列培养板(microchamber-array plate,MCAP)。使用MCAP,可以简单、高效地实现规模化制备均一的MSC微球。此外,通过MCAP可以大量收集MSC微球分泌的含有治疗因子的条件培养基(conditioned medium,CM),其对多种类型的神经损伤均有显著保护作用。综上所述,本selleck STM2457研究拟为大规模提升MSC的治疗潜力提供一种实用的方法,对TBI和electric bioimpedance其他组织修复具有重要意义。【目的】研制大规模提升MSC治疗潜力的3D培养板,提高MSC治疗潜能和实用性。【方法】(1)使用Rhino 6设计MCAP并用ABS材质使用熔融层积FDM的方式进行3D打印。MCAP用琼脂糖包被后进行MSC 3D培养,培养3天后收集MSC微球和条件培养基,并以收集到的微球形态、数量及操作难易为指标对MCAP进行改良。将改良好的MCAP培养的MSC微球与MSC传统3D培养方式—HD培养的MSC微球进行粒径、形态、细胞活力方面的对比。(2)收集传统2D培养、HD培养及MCAP培养的MSC提取RNA,用q PCR检测BDNF、VEGF、b FGF、SDF-1、PLGF等营养因子的表达水平,分别选择3种培养方式的最佳培养条件下的MSC进行RNA-seq,系统的比较MSC旁分泌功能,将其对应的条件培养基进行蛋白芯片检测,其对应的微球进行免疫荧光染色,分别从基因和蛋白水平比较不同培养方式下MSC的旁分泌功能。(3)收集传统2D、HD及MCAP三种培养方式的最佳培养条件下的CM,在小鼠海马神经元细胞系的复杂损伤模型—拉伸损伤中通过观测细胞形态、细胞活力及细胞损伤标志物对比其损伤保护效果。通过细胞凋亡、坏死及铁死亡模型进一步对比其对特定损伤的保护作用。通过血管静脉内皮细胞迁移模型及血管形成模型对比其对损伤后的血管重塑作用。(4)收集MCAP-CM用3KD透析袋进行透析,去除营养因子外的副产物并用蔗糖进行不同程度的浓缩。将不同预处理后的r CM在小鼠TBI后立即给予尾静脉注射,12h后取损伤部位组织,q PCR检测铁死亡、凋亡、炎症损伤标志物,选取最佳治疗组进行RNA测序,系统性检测r CM对TBI的治疗作用。(5)在损伤后12h进行Evans blue染色,观测r CM对血脑屏障功能恢复的影响。在损伤后7day进行CD31、Iba1、Arg-1等免疫荧光染色,检测r CM对TBI后血管重塑及炎症的影响。在损伤后1month内不同时间点进行平衡木、转棒、高架十字及新物体识别等行为学实验,检测r CM对TBI小鼠运动、情绪和认知功能的影响。【结果】(1)受向日葵盘状花轴可规模化产生高度均一的种子启发,设计并3D打印制作了MCAP。与传统的平底式培养皿不同,MCAP的底部有许多均匀阵列的微腔,在一个125×85mm的MCAP上排列有近1000个微腔。对微腔进行3次改良,最终微腔呈上大下小结构,顶部开口为3mm的正方形、腔室中部为倒棱台状、腔室底部为直径2mm的半球、微腔深1.5mm、相邻腔室间隔为线型时,细胞可均匀沉降至微腔底部的半球中形成大量规则、均一的细胞微球。与HD培养相比,MSC微球培养效率提高了30—40倍。(2)在微球形态上,MCAP来源的MSC微球的大小更加均一,变异系数是0.0842,且符合正态分布。HD来源的MSC微球变异系数为0.1895,且不符合正态分布,表明MCAP培养的MSC微球更为均一。Live/Dead染色显示,虽然HD和MCAP培养的细胞微球均保持高活力水平,但MCAP组的细胞活力仍显著高于HD组。(3)在HD培养中,最佳培养密度是6×10~4/m L,MCAP的最佳培养密度是1.2×10~5/m L。HD、MCAP、2D最佳培养条件下的MSC RNA-seq结果表明,HD和MCAP培养的微球高度相似(R>0.8)。HD、MCAP与2D MSC差异基因GO分析表明,environmental information processing通路显著富集,对此通路基因进行KEGG分析,PI3K-AKT、c GMP-PKG、JAK-STAT等调控细胞增殖、分化、促进细胞存活的通路显著富集,表明3D培养更有利于干细胞生长。此外,促血管再生基因(VEGF、b FGF)也在两种3D培养微球中显著高表达。在关于神经系统相关基因分析中,HD和MCAP培养的微球相关基因变化一致,对其进行GSEA分析,其中neuro active基因集与2D培养相比在两种3D培养中显著富集。(4)蛋白芯片检测结果同样表明,PI3K-AKT通路,血管再生通路在HD组和MCAP组显著富集,与RNA-seq结果一致。用q PCR对其中代表性基因进行验证,神经营养因子:BDNF、GDNF、PLGF;促进神经再生因子:G-CSF、SCF、SDF-1;血管再生因子:b FGF、VEGF、HGF;抗炎因子:IL-10、TSG-6;抗氧化因子:IGF-1等均可上调几十到几百倍。免疫荧光染色结果也表明3D培养的干细胞微球中含大量细胞因子(BDNF、HGF、IGF-1、VEGF等)。以上结果表明,HD培养与MCAP培养对MSC旁分泌功能的调控作用一致,均可显著增强MSC旁分泌功能。(5)细胞拉伸损伤中MCAP-CM表现出最显著的保护效应,Erastin和RSL3诱导的铁死亡模型、星孢菌素诱导的凋亡模型、H_2O_2诱导的坏死模型及HUVEC血管形成及迁移实验中,与2D条件培养基相比,3D干细胞条件培养基的保护作用均更为显著,MCAP-CM和HDCM保护作用一致,表明MCAP是可替代HD培养的一种更高效、实用的可规模化增强干细胞治疗潜能的培养方式。(6)透析后条件培养基由粉色变为近透明,表明以酚红为代表的治疗非必需物质被去除。TBI后立即给予条件培养基,12h后取损伤部位进行检测,q PCR结果表明:条件培养基透析后原浓度治疗效果www.selleck.cn/products/ly2157299最佳,可发挥抗炎、抗坏死等保护作用。将损伤部位进行RNA测序,TBI组和条件培养基给药组差异基因分析结果表明:条件培养基给药组抗凋亡、促进神经再生、血管重塑和抗炎相关基因上调而促进凋亡、抑制血管重塑和促炎相关基因下调。(7)平衡木、转棒、高架十字和新物体识别等动物行为学结果表明,r CM可以促进小鼠运动功能恢复,并对认知功能有所改善。损伤后12h,Evans blue染色中给药组损伤部位染色面积较小,颜色较浅,表明r CM可以促进血脑屏障功能恢复。损伤1week后,CD31免疫荧光结果表明,r CM可以促进损伤部位血管重塑;Iba1和Arg-1染色表明,r CM可以抑制小胶质细胞过度激活并促进其向抗炎表型的M2型转化;同时观察到损伤部位空洞较小,表明r CM可以减少TBI后组织丢失。【结论】(1)设计并制备了一种微腔阵列培养板,可以实现均质MSC微球的规模化生产,与经典的悬滴培养相比,培养效率提高了约40倍。(2)MCAP可从基因到蛋白水平系统性增强MSCs的旁分泌功能。(3)在体外细胞损伤模型中,MCAP培养的MSCs对神经细胞的拉伸、铁死亡、凋亡、坏死及血管内皮细胞的多种损伤类型均表现出显著的保护作用。(4)在TBI小鼠中,MCAP培养的MSCs表现出对组织修复的巨大治疗潜能。(5)本研究为提高MSCs的治疗潜能提供了一种实用、便捷的培养装置,并在规模上满足治疗需求,具有良好的临床应用前景。