1.背景甜味受体不仅表达于味蕾,还表达于其他组织器官,口腔外甜味受体功能解析一直是研究热点。文献报道单核细胞、T细胞、B细胞、以及NK细胞中均有甜味受体表达,且甜味受体激活后NK细胞杀伤活性增强,而外周单核细胞也对甜味受体激动剂具有趋化性。上述研究均提示甜味受体具调节细胞免疫功能潜能。课题组前期证实甜味受体表达于巨噬细胞,且甜味受体抑制剂可拮抗黄芪多糖增强巨噬细胞吞噬免疫功能。但甜味受体是否具调控巨噬细胞吞噬免疫功能,且黄芪多糖是否经甜味受体增强巨噬细胞吞噬免疫功能尚未知。2.目的(1)验证甜味受体能否调控巨噬细胞吞噬免疫功能及机制探索。(2)探究甜味受体是否为黄芪多糖调控巨噬细胞吞噬免疫功能的作用靶点之一。3.方法3.1甜味受体在巨噬细胞上表达及调控吞噬免疫功能研究首先通过实时荧光定量PCR法和免疫荧光法在转录水平和蛋白层面证实甜味受体表达于巨噬细胞中。接着利用三种甜味受体激动剂观察甜味受体激活后对RAW264.7细胞吞噬中性红、荧光微球、大肠杆菌的影响,以及对RAW264.7细胞趋化迁移能力、骨架蛋白重塑能力、炎症因子分泌的影响。最后通过si RNA干扰技术,明确甜味受体参与RAW264.7细胞吞噬、迁移、骨架蛋白重塑的调控。3.2甜味受体调控RAW264.7吞噬免疫功能机制研究首先利用钙离子荧光探针法(Flou4-AM),实时观察甜味受体活化后RAW264.7细胞荧光强度变化,明确甜味受体激活对RAW264.7细胞内钙离子释放的影响。接着Western blot法检测甜味受体激动剂处置RAW 264.7细胞后,ERK1/2、Rho A、MLC-2蛋白磷酸化情况,明确甜味受体能否激活ERK1/2和Rho A信号通路。最后,利用选择性PKCβ抑制剂LY317615、ROCK阻断剂Y27632、MEK抑制剂PD98059Captisol对RAW264.7细胞进行干扰,明确甜味受体激动剂是否通过上述信号分子调控巨噬细胞吞噬免疫功能。3.3黄芪多糖改善巨噬细胞吞噬免疫功能及甜味受体抑制剂干扰研究首先通过实时荧光定量PCR法和免疫荧光法在转录水平和蛋白层面证实甜味受体表达于小鼠胸腺和脾脏中的巨噬细胞上。其次,在C57小鼠中明确黄芪多糖可增强巨噬细胞吞噬免疫功能,同时观察甜味受体抑制剂对该作用的干扰。最后,利用环磷酰胺构建免疫低下小鼠模型,并观察黄芪多糖对该模型下巨噬细胞吞噬免疫功能影响,同时观察甜味受体抑制剂的干扰作用。上述两部分实验将从整体动物层面证实甜味受体可能为黄芪多糖调控巨噬细胞吞噬免疫功能的靶点Medullary carcinoma。3.4黄芪多糖经甜味受体调控巨噬细胞吞噬免疫功能机制研究首先对黄芪多糖进行荧光标记,并观察黄芪多糖荧光标记物与RAW264.7细胞结合情况,证实黄芪多糖作用于细胞膜受体。接着证实黄芪多糖可增加RAW264.7细胞吞噬中性红、荧光微球、大肠杆菌能力,同时利用Transwell法、划痕法和鬼笔环肽染色法明确黄芪多糖可调控RAW264.7细胞的迁移和骨架蛋白重塑。然后再运用si RNA干扰技术和甜味受体抑制剂,观察其对黄芪多糖增强RAW264.7细胞吞噬、迁移、骨架蛋白重塑能力的影响。此外,Western blot法观察黄芪多糖刺激RAW264.7细胞后ERK1/2、Rho A、MLC-2蛋白磷酸化情况。最后,利用选择性PKCβ抑制剂LY317615、ROCK阻断剂Y27632、MEK抑制剂PD98059对RAW264.7细胞进行干扰,明确黄芪多糖是经甜味受体/Rho A/MLC-2通路调控巨噬细胞吞噬、迁移及骨架蛋白重塑能力。4.结果4.1甜味受体表达于小鼠巨噬细胞且能调控巨噬细胞吞噬免疫和分泌功能实时荧光定量PCR结果显示甜味基因表达于巨噬细胞RAW264.7中,免疫荧光染色结果也证实甜味受体及其下游信号分子共表达于巨噬细胞中。甜味受体激动剂阿斯巴甜、三氯蔗糖和糖精钠(0.25、0.5、1 m M)呈浓度依赖性增强RAW264.7吞噬中性红、荧光微球以及大肠杆菌能力(p<0.05),而si RNA干扰甜味基因后,可显著逆转上述激动剂增强巨噬细胞吞噬能力(p<0.05)。Transwell和划痕实验结果显示甜味受体激动剂阿斯巴甜、三氯蔗糖和糖精钠可增强RAW264.7细胞迁移能力,Factin荧光染色亦证实上述激动剂可增强RAW264.7细胞骨架蛋白重塑能力(p<0.01)。最后,实时荧光定量PCR结果显示甜味受体激动剂三氯蔗糖(0.5、1 m M)可促进RAW264.7细胞分泌IL-1β、NF-kβRel A、TNF-α能力(p<0.05),且免疫荧光染色证实当给予三氯蔗糖(1 m M)12、24h后,RAW264.7细胞M1亚型标志因子i NOS阳性率增加,提示RAW264.7细胞M1型极化。4.2甜味受体经Rho A/ROCK1/MLC和ERK/MLC调控RAW264.7细胞吞噬免疫功能Flou4-AM探针法证实甜味受体激动剂可促进RAW264.7细胞内Ca~(2+)释放(p<0.01),提示甜味受体可通过第二信使Ca~(2+)影响RAW264.7吞噬功能。此外,甜味受体激动剂阿斯巴甜、三氯蔗糖和糖精钠(1 m M)作用RAW264.7细胞15min、30min、60min后,可显著升高ERK1/2、Rho A和MLC-2蛋白磷酸化水平(p<0.05),而当给予PKCβ、ROCK、MEK特异性抑制剂后,可逆转甜味受体激动剂增强RAW264.7细胞吞噬中性红和大肠杆菌能力,以及逆转甜味受体激动剂增强RAW264.7细胞迁移和骨架蛋白重塑能力(p<0.05)。4.3黄芪多糖可增强小鼠巨噬细胞吞噬免疫功能而甜味受体抑制剂能逆转其作用实时荧光定量PCR和免疫荧光染色结果显示甜味基因和蛋白表达于小鼠胸腺、脾脏中的巨噬细胞上。接着动物实验证实黄芪多糖(200 mg/kg)可显著增强C57小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性、自然杀伤细胞活性、血清溶血素含量、脾脏指数以及血清溶血素(p<0.05);与黄芪多糖组相比作用甜味受体抑制剂可拮抗黄芪多糖增强小鼠免疫功能作用(p<0.05)。与免疫抑制模型组相比,黄芪多糖(200mg/kg)可显著提升免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性、T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖活性、自然杀伤细胞活性、血清溶血素含量、Ig M含量和TNF-γ含量(p<0.05);与黄芪多糖组相比,甜味受体抑制剂可逆转黄芪多糖对免疫低下小鼠的免疫增强作用(p<0.05)。4.4黄芪多糖可经甜味受体-RhCrizotinib抑制剂o A/MLC-2通路增强小鼠巨噬细胞吞噬免疫功能FITC亲核反应成功合成黄芪多糖荧光标记物,激光共聚焦显示黄芪多糖与RAW 264.7细胞膜结合,提示其作用于膜受体。黄芪多糖(400μg/m L)可显著增强RAW 264.7吞噬中性红、荧光微球、大肠杆菌能力(p<0.05)。且Transwell和划痕实验显示其亦可增强RAW264.7细胞迁移能力(p<0.05),Factin荧光染色亦证实黄芪多糖可增强RAW264.7细胞骨架蛋白重塑能力(p<0.05)。免疫荧光染色结果证实黄芪多糖可促使RAW264.7细胞发生M1极化(i NOS阳性率升高)。而甜味受体抑制剂和si RNA干扰后,上述作用可被拮抗(p<0.05)。黄芪多糖(400μg/m L)可显著提高Rho A、MLC-2蛋白磷酸化水平(p<0.05),当给予PKCβ、ROCK特异性抑制剂后,黄芪多糖增强RAW264.7细胞吞噬中性红、迁移以及骨架蛋白重塑能力均被显著拮抗(p<0.01)。5.结论(1)甜味受体表达于巨噬细胞,且可经Rho A/ROCK1/MLC通路和ERK/MLC通路调控巨噬细胞吞噬免疫和分泌功能。(2)黄芪多糖可经甜味受体-Rho A/MLC-2通路增强巨噬细胞吞噬免疫功能。