关节骨软骨损伤是晚年发展成骨关节炎(OA)的一个重要危险因素,并且软骨损伤后自我修复能力有限,同时伴随着软骨下骨的退化和病变,因此需要进行骨软骨的治疗与修复。传统的骨软骨缺损治疗手段各有不足,难以重建关节骨软骨的多层功能性结构,组织工程则是近年来治疗骨软骨缺损的最有希望的手段。理想的骨软骨组织工程Gefitinib小鼠支架需要具备良好的机械性能、类似细胞外基质(ECM)的理化性能,同时具有诱导组织再生的优异的生物活性,水凝胶材料在上述方面具有较大的优势。生物3D打印技术作为制造支架的新技术,能够根据要求构建出个性化支架,具有不同的孔洞和分层结构,可有效模拟天然组织的组织复杂性和梯度结构。因此,本文通过模拟天然关节骨软骨的分层结构,基于水凝胶与ECM高度相似的性质以及生物3D打印技术,构建出双层定向的骨/软骨一体化支架,以期实现诱导骨软骨一体化修复再生。关节软骨由分布在ECM中的软骨细胞组成,因此,为了治疗软骨损伤,应该适当地制造ECM。选用甲基丙烯酸酯化明胶(Gel MA)、壳selleck NMR聚糖(CS)和丝素蛋白(SF),制备了一系列GMA/CS/SF软骨层水凝胶油墨,并优化出最佳组分5GMA/5CS/7SF作为软骨层支架的打印油墨。采用3D生物打印和定向冷冻技术,结合双网络交联机理,成功构建出5GMA/5CS/7SF软骨层水平/垂直定向支架,并与非定向组进行对比。实验结果表明,5GMA/5CS/7SF软骨层支架的水平定向组和垂直定向组均呈现出具有取向的线型孔隙结构;水平定向结构和垂直定向结构降低了含水率和溶胀率,提高了孔隙率,可达88%以上;水平定向结构具有更小的接触角和适宜的降解率,在第23天时降解至50%,且水平定向结构改善了软骨层支架的抗压能力和结构稳定性,弹性模量和最大抗压强度分别可达0.08MPa和0.07MPa;水平定向组支架和垂直定向组支架均无细胞毒性,且更有利于细胞增殖,同时具有更高的硫酸糖胺聚糖含量,能够为ATDC5细胞提供优良的软骨组织分化环境。对于软骨下骨层的修复,不仅要考虑材料的强度,还需要具有优良的生物活性和骨诱导活性,因此,选用甲基丙烯酸酯化明胶、海藻酸钠(SA)和羟基磷灰石(HA)制备了一系列GMA/SA/HA软骨下骨层水凝胶油墨,并优化出最佳组分5GMA/5SA/7.5HA作为软骨下骨层支架的打印油墨。采用生物3D打印和定向冷冻技术,结合双网络交联机理,成功构建出5GMA/5SA/7.5HA软骨层水平/垂直定向支架,并与非定向组进行对比。实验结果表明,5GMA/5SA/7.5HA软骨下骨层支架的水平定向组和垂直定向组均呈现出具有取向的线型孔隙结构;水平定向结构和垂直定向结构降低了含水率和溶胀率,提高了孔隙率,可达80%以上,且垂直定向结构具有亲水性和较为适宜的降解率,在第44天时降解至65%左右;垂直定向结构改善了软骨下骨层支架的抗压能力和结构稳定性,弹性模量和最大抗压强度分别可达0.16MPa和0.13MPa;水平定向组支架和垂直定向组支架均无细胞毒性,且更有利于细胞增殖,垂直定向组支架具有更优异的矿化能力和更好的早期、中后期促成骨分化能力。根据天然的骨软骨结构,骨与软骨并不是两个单独存在的部分,而是由过渡层将软骨与骨紧密连接成的一个整体。因此选用5GMA/5CS/7SF和5GMA/5SA/7.5HA分别模拟软骨层和软骨下骨层,选用Gel MA、CS和多巴胺(DA)作为过渡层增加结合力(剪切力可达10KPa),采用3D打印和定向冷冻技术构建出双层定向骨/软骨一体化支架(软骨层水平定向、软骨下骨层垂直定向),并与双层非定向组进行对比。实验结果表明,双层定向的支架能够观察到明显的上层水平取向、下层垂直取向的结构,且过渡层部分结合良好;双层定向结构支架有较高的含水率和溶胀率,孔隙率略微下降,但仍保持在70%以上;双层定向结构改善了骨/软骨支架的抗压能力和结构稳定性;双层定向骨/软骨支BH4 tetrahydrobiopterin架的上层水平取向和下层垂直取向的结构有助于促进细胞的成软骨和成骨增殖分化,有潜力促进骨软骨组织的修复再生。