CRISPR/Cas系统作为第三代基因组编辑技术,因组装简单、效率高、易操作等优点,被广泛应用于基因组研究中,成为生命科学领域的革命性工具。该系统可以在基因组目标位点介导碱基插入、缺失及精确替换,加速基因功能研究和作物品质改良。然而,一方面由于物种不同、靶点依赖性等原因,CRISPR/Cas系统的编辑效果也有所差异。另外,专利权原因限制了CRISPR/Cas系统的商业化应用。因此,新型Cas蛋白的发现及CRISPR/Cas系统改造,成为目前研究的热点。CRISPR/Cas12i系统属于Class 2中的V-I型,由REC结构域和NUC结构域组成。与Cas12a家族类似,该蛋白由cr RNA引导,识别富含T碱基的PAM序列。CRISPR/Cas12i系统包含多个家族成员。其中,Cas12i1至Cas12i12等12个成员活性在体外和动物细胞内做了相关研究。为了验证CRISPR/Cas12i在植物系统中的基因编辑效果,我们选择CRISPR/Cas12i3基因组编辑工具进行相关工作,工作进展如下:(1)构建CRISPR/Cas12i3介导的水稻编辑体系并成功应用:利用水稻密码子优化的Cas12i3与cr RNA表达盒组装CRISPR/Cas12i3骨架载体,单靶点设计针对水稻内源基因Os YSA、Os NAL、Os MIR396e和Os PYL6,检测该体系编辑效果。结果显示单靶点载体均成功实现基因编辑且编辑效率在6.25%～82.5%,证明CRISPR/Cas12i3在水稻中介导基因编辑的可行性。(2)CRISPR/Cas12i3串联pre-cr RNA(DR-spacer-DR-spacer)构建多靶点编辑体系:因CRISPR/Cas12i3靶点不同编辑效率存在差异,期望以pre-cr RNA(DR-spacer-DR-spacer)串联靶点的方式提高CRISPR/Cas12i3系统编辑效率。本研究构建两个多靶点串联载体Array1和Array2均未发现基因编辑事件的发生,推测Cas12i3加工多重pre-cr RNA(DR-spacer-DR-spacer)效率低。(3)构建Cas12i3介导的成熟cr RNA编辑系统iMAGE(CRIPSR/Cas12i3-based Multiplex DR-spacer Array Genome Editing system),实现多靶点编辑:鉴于Cas12i3显示加工多重pre-cr RNA的低活性,我们设计了成熟cr RNA的编辑系统iMAFulvestrant临床试验GE。本研究利用CRISPR/Cas12i3和iMAGE系统针对水稻Os Nramp5基因分别设计单靶点和多靶点,结果表明,相对于单靶点载体编辑效率的0%～17.7%,使用iMAGE系统随机设计的5个靶点串联载体iMAGE-Array:A和iMBiomass reaction kineticsAGE-Array:B突变效率分别为47.32%和38.39%。iMAGE系统既简化载体构建流程又缩短实验周期,在实现多重编辑的同时提升单个基因突变效率。(4)利用iMAGE系统实现染色体结构变异:染色体结构变异(Structural variation,SV)是加速植物育种的重要动力,我们利用CRISPR/Cas9和iMAGE系统靶向Os HPPD和Os Ubi2构建多靶点载体,证明了Cas12i3蛋白同样介导染色体结构复制,且Cas12i3介导的DNA结构变异频率与Cas9相比更高,推测Cas12i3切割DNA双链产生粘性末端。(5)基于dCas12i3的胞嘧啶碱基编辑器(i BEs)和腺嘌呤碱基编辑器(i ABEs):为了拓宽Cas12i3应用领域,本研究预测Casselleck PEG30012i3催化活性中心并突变成功获得4种dCas12i3突变体,不同突变体与Anc689、Tad A8e分别融合构建胞嘧啶碱基编辑器(i BEs)和腺嘌呤碱基编辑器(i ABEs)系列载体。结果显示i BEs中仅i BE~(844)检测到编辑,i ABEs中4种突变体均实现精确替换。相同的是,i BE~(844)和i ABE~(844)分别在i BEs和i ABEs中效果最佳,推测可能与E844A突变保留了较完整的识别活性有关。总之,i BE~(844)和i ABE~(844)的开发成功将Cas12i3应用于碱基编辑领域。(6)基于dCas12i3~(844)的i ABE~(844)的编辑特征研究:为进一步说明i ABE~(844)编辑范围、效率等特征,在水稻基因组设计25个靶点经潮霉素筛选取阳性愈伤组织检测。高通量测序结果表明,与Cas12a相似,i ABE~(844)主要编辑窗口位于A9-A12位,编辑效率在10%左右。另外,靶向p35S:e GFP~(mut)恢复绿色荧光活性及Os ACC基因突变体的除草剂筛选进一步验证了i ABE~(844)介导碱基精确替换的能力。综上所述,本研究在水稻中证实了CRISPR/Cas12i3具有介导基因编辑的能力,构建融合多个cr RNA表达盒的iMAGE系统成功实现多靶点编辑和染色体结构变异。同时,首次发现4种dCas12i3突变体的碱基编辑器中i BE~(844)和i ABE~(844)编辑活性最佳,并对i ABE~(844)编辑工具特征进行评估。以上研究工作扩充了基因编辑工具,为基因编辑应用提供更多的工具选择。