研究背景:过去二十年,突发公共卫生事件频发,非典冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、新型冠状病毒等RNA病毒引发的疫情,给人类生命健康带来了极大的CP-690550威胁,而RNA病毒基因组的高度变异性,更是给病毒检测带来了巨大的挑战。病原体快速准确鉴定是战胜疫情的关键。核酸测序技术,尤其是近些年发展起来的纳米孔测序技术,在重大疫情的病原体发现中发挥越来越重要的作用。然而病毒滴度低、样本背景复杂以及大量宿主核酸的干扰等问题造成的漏检,是病毒检测技术亟待攻克的技术瓶颈。CRISPR/Cas系统的特点是序列依赖性识别,这使其检测到的靶序列具CL 318952研究购买有特异性,且可实现多重病原体检测。CRISPR/Cas家族的RNA酶Cas13d可以通过单链引导RNA(Cr RNA)与靶RNA特异性结合。本文旨在利用Cas13d的特性实现RNA病毒的靶向富集,建立一novel antibiotics种快速准确的RNA病毒检测方法。研究目的:针对复杂背景条件下RNA病毒检测的需求,本研究将CRISPR/Cas13d和纳米孔测序技术相结合,建立一种可靶向富集RNA病毒基因组的病毒检测方法。该方法的建立旨在大幅度降低背景序列的影响,提高RNA病毒检测的灵敏度,从而实现对RNA病毒的精准鉴定。方法与结果:我们建立了基于CRISPR/Cas13d的靶向技术和纳米孔测序技术构建病毒核酸检测方法,并应用包含新型冠状病毒序列的病毒模拟物对其进行初步验证。该方法通过突变型Cas13d和Cr RNA特异结合混合RNA样品中病毒RNA,通过生物素-链霉亲和素系统实现d Cas13d-靶序列复合物的富集,富集到的病毒RNA应用纳米孔测序技术获得核酸序列,进一步通过生物信息学比对实现病毒的鉴定。为建立该方法,我们首先设计了4种剪切活性结构域(HEPN)突变的Cas13d蛋白突变体,通过剪切活性分析和亲和力常数测定,我们发现突变体H863A的剪切活性被完全破坏,其与设计的靶序列亲和力是野生型Cas13d的3倍。我们针对新型冠状病毒分别设计合成了特异性Cr RNA,同时构建了包含对应病毒序列的病毒模拟物用于方法评价。初步方法验证结果表明,该方法可实现RNA病毒的有效富集。此外,我的另一部分工作是建立了基于多重PCR和纳米孔测序技术的12种消化道病原体现场检测方法。我们针对腺病毒、诺如病毒、星状病毒、副肠孤病毒、柯萨奇病毒、轮状病毒、杯状病毒等12种消化道病毒设计了特异性引物,验证了引物特异性,优化了多重PCR扩增条件,构建了快速建库测序体系,最后对病原体的检测灵敏度进行了评价。结果显示,建立的12种消化道病原体多重PCR检测体系可以对所有靶序列进行有效扩增。我们分别用12种病原体混合DNA模拟物和三种轮状病毒A、B、C的混合RNA样品对该方法进行了灵敏度分析,结果表明,该方法检测灵敏度可达10~3拷贝/m L,与实时定量荧光PCR技术的灵敏度相当。研究结论:本文建立了两种靶向富集病毒基因组的病毒检测方法,通过降低背景序列对测序结果的影响,提高病毒检测的灵敏度和特异性,同时可获得病原体序列信息,减少了假阳性问题,为病原体溯源提供依据。综上,本文建立的方法可为突发公共卫生事件的病原体检测提供有力支撑。