背景和目的遗传性神经肌肉病(Hereditary neuromuscular disease,HNM)是一类以肌肉萎缩无力为主要特征的神经肌肉系统疾病,具有显著的遗传异质性和表型异质性,临床分型和遗传学分型均非常复杂给疾病诊疗带来了IDN-6556巨大挑战。遗传性痉挛性截瘫(Hereditary Spastic Paraplegia,HSP)是遗传性神经肌肉病的一种,临床上主要表现为缓慢发展的肌肉萎缩和下肢迟滞性痉挛性截瘫。目前已鉴定78种HSP亚型,包括80个致病基因,遗传方式具有显著多样性,目前仍不断有新致病基因和新致病变异陆续被发现,对HSP相关基因分子机制的研究,不仅有助于对疾病发生过程的深入理解,还能为HSP的治疗探索提供立论依据。课题组前期对本地区的HNM患者进行了系统收集和临床遗传学分析,建立了包括69例患者的HNM队列,并完成了31例患者的分子诊断。在其中一例临床诊断为HSP的常染色体显性遗传家系中,通过序贯性遗传学检测方案,在ERLIN2基因发现了一个与家系表型共分离的致病性杂合错义突变,该变异既往未见文献和数据库报道。既往研究发现,ERLIN2基因双等位功能缺失型突变可导致常染色体隐性遗传的HSP18,但具体发病机制尚未明确,难以有效指导疾病的诊疗与防控。更重要的是,HSP 18是否存在常染色体显性遗传方式仍未知,ERLIN2基因的杂合错义突变能否通过功能获得(GOF)的方式导致疾病尚待明确,两种遗传模式是否存在共同的分子机制也有待进一步研究。传统的观点认为,HSP是一种典型的神经退行性疾病,多在青少年乃至成年期起病,随着年龄增大而逐渐加重。近年来不断有研究提示,神经退行性疾病存在发育遗传学基础,其在神经发育阶段即存在显著的缺陷,神经分化障碍导致神经元的数量减少,在发病期因神经功能失代偿而表现出典型的临床症状。近年来,诱导多潜能干细胞技术(induced pluripotent stem cell,iPSC)和基因编辑技术快速发展,能够很好地模拟遗传病的发生、发展过程,是研究遗传病发病机制的良好体外模型,在遗传病发病机制的解析中发挥了不可替代的重要作用。因此,本研究利用患者来源的诱导多能干细胞和基于CRISPR/Cas9技术构建的ERLIN2基因双等位敲除iPSC模型,旨在探讨:1.HSP18中,ERLIN2基因突变是否存在常染色体显性遗传致病模式;2.ERLIN2基因杂合错义突变的致病机制是什么;3.ERLIN2基因不同突变类型与遗传模式是否具有共同的分子机制。材料和方法1.患者临床资料收集及突变分析经家系成员知情同意与陆军军医大学伦理委员会批准,收集家系成员的相关临床资料,抽取外周血进行序贯性遗传学检测。对全外显子组测序数据进行变异筛选、多态性数据库比对、Sanger测序验证、共分离分析以及突变有害性预测,明确该家系的候选致病变异。2.ERLIN2杂合错义突变致HSP的机制研究1.1患者来源iPSC模型的构建抽取患者及家系成员外周血,分离和培养红系祖细胞,并采用Erythroid Progenitor Reprogramming试剂盒进行诱导重编程,获得具有相同遗传背景的iPSC细胞系,进行核型分析、多能性检测与突变验证。2.2致病机制研究设置患者来源的iPSCs为病例组,以家系内正常成员来源的iPSCs为对照组。诱导iPSCs分化为运动神经元细胞,检测分化效率。诱导iPSCs分化为神经干细胞,通过IP-质谱分析蛋白质相互作用;通过流式细胞术检测分析细胞增殖与凋亡情况;采用Western Blot测定凋亡相关蛋白的表达的差异;使用激光共聚焦显微镜对细胞内钙流进行成像,分析细胞内钙水平变化;开展病例组和对照组神经干细胞转录组测序,对差异表达基因进行GO、KEGG和GSEA生物信息学分析,探究病例组神经干细胞基因表达与富集信号通路的变化情况。3.ERLIN2基因双等位缺失致HSP的机制研究3.1 ERLIN2基因双等位缺失iPSC模型构建使用软件设计特异性强、敲除效率高的gRNA序列,用pSpCas9(BB)-2A-EGFP载体构建质粒,经细胞核电穿孔转染后,挑选并鉴定双等位敲除的单克隆细胞。利用正常人来源的hiPSC模式细胞SBU,获得ERLIN2基因双等位缺失的模型,进行测序分析、m RNA表达检测以及蛋白质含量测定等鉴定。3.2分子致病机制研究定向诱导ERLIN2 KO的hiPSC系分化为神经干细胞,检测神经干细胞凋亡水平与细胞周期的变化情况,通过Western Blot检测凋亡相关蛋白和细胞周期蛋白在表达上的差异;使用激光共聚焦显微镜对细胞内钙流进行成像,分析细胞内钙水平变化;检测分析线粒体膜电位的差异。结果整合分析患者家系的临床资料,分步运用序贯性遗传学检测技术,包括动态突变分析、神经肌肉病基因panel检测、MLPA检测以及全外显子组测序分析,在该家系中发现了一个与家系表型共分离的杂合错义突变,ERLIN2(c.212T>C,p.Val71Ala),该变异既往未见文更多献和数据库报道。综合突变有害性预测工具和ACMG指南的分析结果,判断该变异为可疑致病性变异,可能通过常染色体显性遗传模式导致HSP发病。通过分离培养患者外周血中的红系祖细胞并进行重编程,得到患者来源的iPSCs携带患者特定遗传信息,生长活跃,表达多能性蛋白,具有多向分化潜能。基于患者来源的iPSC模型,探讨ERLIN2 p.Val71Ala突变的致病机制。结果提示,iPSC向运动神经元分化的效率显著降低,且神经干增殖受阻,凋亡明显增加。实验结果表明,ERLIN2 p.Val71Ala突变通过招募E3泛素连接酶RNF213使其功能增强,促进IP3R1的降解,使内质网内Ca~(2+)流出受阻,破坏细胞内钙稳态,导致病理性内质网应激,从而影响神经干细胞的凋亡。内质网应激抑制剂TUDCA可以部分挽救NSCs的凋亡表型。转录组测序的KEGG结果分析和WB结果提示,ERLIN2突变导致的细胞内钙稳态的破坏抑制了MAPK信号通路的活化,从而抑制细胞增殖。利用CRISPR/Cas 9技术构建ERLIN2基因双等位缺失(ERLIN2-KO)iPSC模型实现了该基因的纯合敲除,细胞中未检测到ERLIN2蛋白表达,同时细胞系的干细胞特性得以维持。基于ERLIN2-KO的iPSC模型,定向诱导其分化为神经干细胞并进行细胞凋亡和周期检测,结果发现细胞凋亡水平显著增加,细胞周期明显阻滞在G2/M期。ERLIN2蛋白的缺失导致NSCs中IP3R1降解受阻,进一步增加Ca~(2+)向线粒体的转运,通过降低线粒体膜电位介导细胞凋亡。同时,ERLIN2蛋白缺失使得NSCs细胞周期蛋白B1稳定性减弱,导致细lichen symbiosis胞周期受阻,使得增殖能力下降。结论ERLIN2是细胞中维持钙稳态和ERAD通路的重要蛋白质,除常染色体隐性遗传外,其杂合错义突变也能通过常染色体显性遗传模式导致HSP发病。ERLIN2杂合错义突变可募集E3泛素连接酶RNF213,增强其对IP3R1的降解,阻碍内质网内钙流出,引起病理性内质网应激反应。而ERLIN2双等位缺失使其蛋白功能丧失,解除其对IP3R1蛋白的降解作用,导致内质网Ca~(2+)流出增加,引起线粒体介导的细胞凋亡。两种突变模式的分子机制存在显著差异,但均通过破坏细胞内钙稳态而致病,这为解释HSP的表型异质性和遗传异质性提供了依据,并有助于HSP治疗策略的探索。