蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰是一种进化上保守的翻译后修饰(PTM),在细菌的多种生理和代谢过程中发挥重要作用。乙酰化nursing in the media修饰可以调控酶活,因此可以作为一种很有前途的代谢调控手段。乳酸脱氢酶(LdhA)是NADH依赖的催化丙酮酸合成乳酸的保守酶,其天然酶活经常限制乳酸合成。乳酸商业价值较高,同时也是微生物发酵的主要副产物,其合成调控是代谢工程经久不衰的课题。大肠杆菌作为代谢工程中最常见的宿主之一,被用于合成乳酸在内的大量化学品,但是目前仍不清楚其对大肠杆菌LdhA酶活的影响及调控机制。基于此,本文选取大肠杆菌LdhA为研究对象探究其乙酰化修饰机制。体内和体外两个层面确定大肠杆菌LdhA的乙酰化修饰机制,并探究乙酰化修饰对LdhA功能的影响,最后成功实现乙酰化修饰在乳酸合成调控中的应用。本研究主要结果如下:一.鉴定了大肠杆菌LdhA的乙酰化修饰机制,即LdhA通过乙酰磷酸(AcP)依赖的非酶促机制和乙酰化酶Pat介导的酶促机制乙酰化,乙酰化后的LdhA不可被去乙酰化酶CobB去乙酰化。添加不同碳源培养条件下的LdhA乙酰化程度差异显著,探究发现是由于不同碳源培养条件下导致AcP基底水平不同。不同碳源培养条件下LdhA乙酰化差异是由AcP依赖的非酶促机制调节,在此过程中Pat不发挥调控作用。二.乙酰化修饰可以调控大肠杆菌LdhA的功能。在体外条件下,利用酶催化和非酶催化机制实现人工调控LdhA的乙酰化修饰水平,将Pat、Raf抑制剂CobB和AcP分别与LdhA孵育发现乙酰化修饰降低大肠杆菌LdhA总体酶活。探究还发现乙酰化修饰降低LdhA蛋白水平。三.通过质谱鉴定到大肠杆菌LdhA的四个乙酰化修饰位点,不同位点乙酰化修饰对LdhA酶活的影响不同。结合大肠杆菌LdhA结构分析,这取决于不同赖氨酸位点特定的空间位置。通过同源建模发现,K70位于催化域的远端,该位点乙酰化后对LdhA功能影响较小。K154位于NADH结合结构域,该位点赖氨酸乙酰化使得其与NADH的结合能力下降,导致LdhA酶活下降。K9和K248都与酸性氨基酸形成盐桥,当位点的赖氨酸发生乙酰化时盐桥破坏导致LdhA酶活改变。序列比对进一步表明K248在不同的细菌物种中高度保守,这表明K248是关键氨基酸位点,因此可以作为调节细菌LdhA活性的靶点。乙酰化修饰对Lwww.selleck.cn/products/blz945dhA酶活总体影响是不同乙酰化修饰位点综合作用,解析了赖氨酸乙酰化修饰对大肠杆菌LdhA酶活的影响和调控机制。四.将LdhA的乙酰化修饰应用于乳酸合成调控。LdhA(K9R)突变体保留正电荷,避免该位点被乙醜化,且维持与酸性氨基酸的盐桥能力,最终酶活升高2.5倍,用于合成乳酸,乳酸产量提高1.74倍。LdhA(K154Q-K248Q)突变体不带电荷,模拟乙酰化的状态,酶活降低,在降低乳酸合成的同时,维持细胞正常生长。本研究首次报道了大肠杆菌LdhA的乙酰化修饰机制,探究了乙酰化修饰对LdhA功能的影响,建立了乙酰化修饰在乳酸合成调控中的应用范例。鉴于赖氨酸乙酰化修饰的高度保守性,以及LdhA在不同物种中的保守性,我们的研究可为其他物种乙酰化修饰研究和乳酸相关疾病治疗提供新的思路。