镉(Cadmium,Cd)是农业土壤中危害最大、分布最广的有毒重金属污染物之一。镉具有极强的生物持久性,是引起食物链污染的最重要元素之一。发掘与镉耐性与积累相关基因、明确其调控作物镉耐性与积累的机制是培育耐镉与低耐镉积累作物品种的基础。本课题组前期研究分析比较了ZN8(耐镉大麦基因型)和W6nk2(镉敏感基因型)响应镉胁迫的lnc RNA和mi RNA表达差异,鉴定到一个参与lnc RNA-mi RNAs-靶点相互作用模式的基因HvGAMYB。本研究在对大麦R2R3-MYB家族成员进行全基因组鉴定和系统进化分析基础上,分离克隆HvGAMYB,利用BSMV-VIGS技术和转录组分析初步探讨了HvGAMYB调控大麦耐镉性的机制。同时探讨了外源源类黄酮对大麦镉毒害的缓解效应。主要研究结果如下:1.采用生物信息学方法分析序列相似性和保守结构域,在大麦全基因组中鉴定到110个R2R3-Hv MYB基因,他们相对均匀分布在大麦7条染色体上,这些基因的内含子数量在0-12之间,大部分基因含有1个或2个内含子。通过共线性分析,发现有15个R2R3-MYB片段的重复和6处串联重复。通过系统发育树分析,大麦和拟南芥的R2R3-MYB基因被分为33个亚组。其中HvGAMYB属于S20亚组。在110个R2R3-Hv MYBs的启动子区共发现的21种与响应有关的元件主要可分为光响应元件、植物激素响应元件和胁迫响应元件三大类。不同的R2R3-HLBH589半抑制浓度v MYB基因表达模式不同。其中,HvGAMYB在颖果中的表达量最高,并且参与了大麦对盐胁迫和镉胁迫的响应。2.通过分析耐镉基因型ZN8、镉敏感基因型W6nk2和GP中HvGAMYB的CDS、DNA(包括外显子和内含子)和启动子序列,发现W6NK2和GP的CDS区和启动子序列完全相同,DNA序列只存在一个碱基的差异,但W6NK2与ZN8在CDS、DNA全长分别存在4处和13处碱基差异。在启动子序列上,除了存在多个SNPs外,还有多处碱基片段的缺失和插入。此外,这两个基因型的HvGAMYB启动子元件也存在多处差异。进化树分析表明,GAMYB在藻类(除单细胞轮藻外)和绿色植物中均有分布,大麦GAMYB与小麦和水稻GAMYB蛋白的同源关系最近。转录激活试验CL13900和亚细胞定位实验结果显示,该基因定位在细胞核、细胞质和细胞膜,并且具有转录激活活性。3.利用BSMV-VIGS技术在ZN8中沉默了HvGAMYB基因,水培试验比较分析镉胁迫和正常生长条件下,BSMV-VIGS诱导HvGAMYB基因沉默植株及模拟接种BSMV:GFP植株对镉胁迫的响应,结果表明,与接种BSMV:GFP的植株相比,镉胁迫条件下,BSMV-VIGS诱导HvGAMYB基因沉默导致植物的长势变差,地上部和根部干重降低,植株受镉胁迫更加明显,生长抑制更严重。镉处理10d后,BSMV:HvGAMYB植株的地上部和地下部镉含量分别比BSMV:GFP侵染植株高67%和13%,并且地上部镉积累量也增加。利用转录组测序,比较分析了模拟接种BSMV:GFP和接种BSMV:HvGAMYB植株在正常和镉处理下的差异表达基因,共检测到692个基因在镉胁迫下差异表达。为了验证基因的表达,我们选择其中的16个基因进行RT-q PCR分析,其表达与相应的RNA-Seq数据一致。在这些差异表达基因中,有6个与抗氧化相关的基因在镉胁迫下调,其中有1个基因是类黄酮合成的关键基因Hv CHS。此外,HvGAMYB的沉默抑制了光合作用相关基因的表达,但促进了镉胁迫下活性氧的产生,导致镉诱导的MDA积累和根系ER-Golgi intermediate compartment死亡细胞数的增多。这些结果表明,由HvGAMYB调控的类黄酮合成相关基因和抗氧化相关基因可以通过调控抗氧化机制来改善大麦耐镉性。4.以耐镉基因型ZN8为材料,水培试验研究了外源添加类黄酮(槲皮素)对大麦镉吸收与耐性的影响。结果表明,在10μM Cd胁迫下,外源添加槲皮素能够显著缓解镉对大麦的毒害作用并且减少大麦对镉的吸收,使大麦叶片和根系的镉含量分别较单独镉处理下降了15.3%和25.9%。此外,外源添加槲皮素还能够减少镉胁迫下根系活性氧和MDA的积累,并增强镉胁迫下的根系细胞活力,增强了大麦对镉的耐受性。