天名精内酯酮是卡拉布烷型倍半萜内酯类化合物,广泛分布于天名精属及其相近属植物中。自课题组报道了该化合物的杀菌活性以来,对其杀菌谱、盆栽活性和作用机理等方面进行了大量的研究工作。前期研究发现,天名精内酯酮对小麦全蚀病、小麦白粉病、黄瓜炭疽病等具有很好的保护和治疗效果,亚细胞定位试验证实其作用于小麦全蚀病菌的线粒体,显著影响线粒体呼吸链,但其抑菌作用靶标仍不明确。基于此,本研究以小麦全蚀病菌为供试菌,以时序转录组分析结果为出发点,通过ABPP(Activity-based protein profiAZD9291分子量ling)、NAD~+/NADH比率检测和RNAi技术对天名精内酯酮的候选靶标蛋白进行筛选,进一步采用生理生化指标测定和过表达技术对天名精内酯酮的作用靶标进行验证,明确了天名精内酯酮的抑菌作用靶标。主要研究结果如下:1、通过时序转录组分析天名精内酯酮对小麦全蚀病菌转录水平的影响。结果表明:天名精内酯酮处理不同时间后对小麦全蚀病菌的基因表达水平有明显影响,分别在1 h、2 h、4 h确定1178、2377、2823个差异表达基因;所有差异表达基因被聚类为四个基因簇,其中下调表达趋势基因簇Cluster 1和Cluster 2主要涉及翻译、TCA循环、丙酮酸代谢和氧化磷酸化过程,而上调表达基因簇Cluster 3和Cluster 4主要涉及辅因子生物合成、氧化还原平衡和自噬等生物过程;进一步分析证实天名精内酯酮会促进NAD代谢相关基因的表达,诱导菌体氧化还原稳态破坏和线粒体自噬的发生。以上结果证明天名精内酯酮显著影响小麦全蚀病菌能量代谢和NAD代谢相关过程的转录水平,并且诱导菌体自噬。2、通过ABPP鉴定天名精内酯酮的结合蛋白。结果表明:天名精内酯酮炔基探针CAR-Y能够在离体和活体条件下对小麦全蚀病菌30 k Da、50 k Da、58 k Da和75k Da处蛋白稳定Etoposide供应商标记,并且主要标记于线粒体;经磁珠富集和质谱检测最终确定56个天名精内酯酮疑似靶标蛋白,并且大量涉及NAD~+、NADH转化过程。因此,推测天名精内酯酮的抑菌作用机制与NAD具有相关性。3、检测天名精内酯酮对供试菌NAD~+/NADH比率的影响,结果表明:(1)天名精内酯酮能够显著降低供试菌的NAD~+/NADH比率,并且呈现明显的剂量依赖性和时间依赖性;(2)NAD~+补偿途径能够显著降低供试菌对天名精内酯酮的敏感性;(3)丙酮酸能够显著降低供试菌对天名精内酯酮的敏感性,并且提高天名精内酯酮处理后的NAD~+/NADH比率。以上结果说明,天名精内酯酮的作用靶标与NAD~+/NADH比率降低有关。4、构建NAD相关疑似靶标蛋白的沉默突变体,并测定沉默突变体对天名精内酯酮的敏感性变化。结果表明:复合体I亚基突变体Δnuo49、Δndufv1和ATP合酶亚基突变体Δatp3对天名精内酯酮敏感性显著升高,富马酸水合酶沉默突变体Δfh对天名精内酯酮敏感性无明显变化,而D-乳酸脱氢酶沉默突变体Δdld2对天名精内酯酮敏感性显著降低。由此推测,天名精内酯酮对线粒体呼吸链有显著影响,Nuo49、NDUFV1和ATP3可能是天名精内酯酮的靶标蛋白。5、测定天名精内酯酮对线粒体呼吸链生理生化指标的影响,结果表明:天名精内酯酮能够显著降低供试菌的ATP水平,并诱导超氧阴离子的产生。同时,FCCP处理显著增加天名精内酯酮的抑菌活性并维持对菌体NAD~+/NADH比率的降低,而FCCP降低寡霉素的抑菌活性并提高菌体的NAD~+/NADH比率。以上结果证明,天名精内酯酮对线粒体呼吸链有显著影响,但其作用机制不同于寡霉素。6、构建OE-ndi1、OE-nuo49、OE-ndufv1和OE-nuo78过表达菌株,并检测过表达菌株对天名精内酯酮敏感性和复合体I酶活变化。结果表明:(1)酿酒酵母ndi1(鱼藤酮不敏感的NADH氧化酶)hepatocyte transplantation基因在供试菌中过表后,对鱼藤酮和天名精内酯酮的敏感性显著降低,并提高NAD~+/NADH比率;(2)天名精内酯酮能够显著降低复合体I的活性,2μM天名精内酯酮的抑制率达到74%,IC_(50)值为309.03 n M;(3)OE-nuo49过表达菌株对天名精内酯酮敏感性显著降低。以上结果说明,线粒体呼吸链复合体I是天名精内酯酮的作用靶标之一,其直接作用位点可能是Nuo49亚基。综上所述,天名精内酯酮靶向供试菌线粒体呼吸链复合体I,并降低NAD~+/NADH比率。结合课题组前期研究结果推测天名精内酯酮的作用机制为:天名精内酯酮进入小麦全蚀病菌后快速聚集于线粒体,并作用于线粒体呼吸链复合体I,进而抑制NADH向NAD~+的转化,致使氧化还原稳态失衡,大量ROS随之蓄积,同时ATP合成受阻;此外,在复合体I抑制产生的刺激下,可能通过ROS和AMPK途径激活线粒体自噬,但在天名精内酯酮持续作用下可能致使线粒体过度自噬,发生细胞凋亡,最终使得靶标菌死亡。