家蚕作为具有重要的经济价值的鳞翅目泌丝昆虫,同时也是模式生物。经过几千年的驯化和演变,已经积累了较多的遗传突变材料。家蚕突变体类型主要包括斑纹、体色、体型、茧色突变体等。本课题组在家蚕品种秋丰N饲养过程中发现一种蛹皮表现为黑色的突变体,命名为bpn。该突变体的部分蚕在化蛹时出现蜕皮困难,且雌蛾所产的蚕卵虽能正常发育,却有部分不能孵化,导致孵化率显著低于正常雌蛾所产的卵,这在其他黑蛹突变体中未见报道,是一种新的黑蛹突变体。遗传学分析结果显示,突变体bpn的突变性状由1个隐性基因控制,且位于常染色体上,遵循孟德尔遗传规律。本研究采用多态性SSR分子标记对bpn基因进行连锁分析和定位克隆,并采用2-DE和转录组分析突变体蛹皮中总蛋白的变化,阐述突变体bpn的形成原因以及突变的发生对蛹皮蛋白和BmHEL基因的影响,对完善黑色素形成机制及丰富家蚕生长发育的分子机制具有重要意义。本研究获得的主要研究结果如下:1、家蚕突变体bpn的表型特征和遗传分析统计分析突变体bpn的孵化率在50%-60%之间,远远低于正常品种秋丰N(90%以上)。遗传分析结果显示,P50和突变体bpn的杂交后代F_1个体均表现为正常蛹;F_2代出现性状分离,有正常蛹和黑色蛹两种表型,分离比为3:1;回交群体(BC_1F、BC_1M)出现正常蛹和黑色蛹两种表型,分离比均为1:1。根据孟德尔遗传定律,确定控制突变体bpn突变性状的基因为隐性基因,且位于家蚕常染色体。2、bpn基因的连锁分析及精细定位以P50和突变体bpn为亲本配制F_1代,根据家蚕雌性染色体不发生交换的特性,将F_1代雌蛾回交突变体bpn雄蛾组配BC_1F群体,用于bpn基因的连锁分析;F_1代雄蛾回交bpn突变体雌蛾组配BC_1M群体,用于bpn基因的精细定位。遗传分析结果显示bpn基因位于常染色体,因此排除1号性染色体。根据已构建的家蚕SSR分子标记连锁图,以P50、突变体bpn及其杂交后代F_1的基因组为材料,筛选剩余27条染色体上的多态性SSR分子标记,并用筛选出的多态性SSR标记对BC_1F中的10个正常个体和10个突变个体进行连锁分析,确定bpn基因位于26号染色体。使用BC_1M群体中的200个突变个体进行精细定位。结果显示bpn基因位于S26-4-12和S26-2-14两个分子标记之间,物理距离约211 kb,包含6个候选基因:KWMTBOMO15782、KWMTBOMO15783、KWMTBOMO15784、KWMTBOMO15785、KWMTBOMO15786和KWMTBOMO15787。3、候选基因表达谱的筛选及结构分析为了确定目的基因,分析了候选区域内6个基因在蛹期的表达情况。以秋丰N和突变体bpn的蛹皮c DNA为模板进行q RT-PCR,结果显示:KWMTBOMO15783在蛹期不表达,KWMTBOMO15787的相对表达量在秋丰N和突变体bpn的蛹皮中无显著差异,而KWMTBOMO15782、KWMTBOMO15784、KWMTBOMO15785和KWMTBOMO15786的相对表达量在秋丰N和突变体bpn的蛹皮中有显著差异,结果表明,候选基因可定为Knarrative medicineWMTBOMO15782、KWMTBOMO15784、KWMTBOMO15785和KWMTBOMO15786。根据KAIKObase提供的基因注释信息可知:KWMTBOMO15782,KWMTBOMO15784CX-5461供应商和KWMTBOMO15785均为纤毛和鞭毛相关蛋白基因,KWMTBOMO15786为ebony基因。对4个候选基因进行序列分析,结果显示KWMTBOMO15782和KWMTBOMO15784和KWMTBOMO15785的序列与参考序列均无差异,而ebRaf抑制剂ony基因的6号外显子中部插入一段长度为99 bp的poly A结构,功能区出现一个终止密码子TAA;8号外显子和10号外显子部分缺失,9号外显子全部缺失。结果表明,ebony基因发生了无义突变,使其抑制黑色素的功能丧失,黑色素累积,从而导致突变体bpn的蛹皮出现黑化表型。4、蛹皮总蛋白的2-DE分析以及蚕卵中BmHEL的表达分析为确定突变体的发生对蛹皮总蛋白是否产生影响,采用2-DE分析了秋丰N和突变体bpn在蛹期不同发育时间的蛹皮总蛋白表达情况,并通过转录组和q RT-PCR验证2-DE结果。结果显示,秋丰N和突变体bpn的蛹皮蛋白表达稳定,且在不同时间点,两者之间均存在3个差异显著的蛋白,质谱鉴定该3个差异蛋白为KWMTBOMO11902,KWMTBOMO11904和KWMTBOMO11906,均为30K蛋白。结果表明,突变体bpn蛹皮中30K蛋白的表达发生了变化。BmHEL基因在蚕卵孵化过程中起到软化卵壳,促进孵化的作用,由于突变体bpn的自交蚕卵孵化率显著低于秋丰N,猜测可能与BmHEL基因有关。利用q RT-PCR分析BmHEL基因在秋丰N和突变体bpn蚕卵中的表达情况,结果显示:在点青期,BmHEL在秋丰N和突变体bpn蚕卵中的表达量均较低,是由于孵化酶的作用是软化卵壳,在蚕卵孵化前期一直处于低表达;从点青直至孵化,突变体bpn蚕卵中BmHEL的表达量均显著高于秋丰N蚕卵,结果表明,突变体bpn部分蚕卵孵化困难,需要更多的孵化酶软化卵壳,导致BmHEL基因的高表达。以上结果表明,家蚕ebony基因的突变不仅使家蚕蛹皮的黑色素形成异常,呈现黑色表型,且可能对30K蛋白、孵化酶等与生长发育关系密切的基因也产生了重要影响。因此,研究bpn突变体发生机制对完善黑色素形成机制及丰富生长发育的分子机制具有重要意义,值得进一步研究。