昆虫是自然界中数量及种类最多的一类无脊椎动物。翅膀是昆虫重要的器官之一,其在躲避天敌、相互交流、长途迁徙、觅食与求偶等方面发挥重要作用。基于家蚕(Bombyx mori)具备完善的基因组信息、清晰的遗传背景以及成熟的遗传操作平台,因此,其是研究昆虫翅膀发育的最佳模式生物之一。在家蚕中,翅相关的研究不仅揭示了昆虫翅发育的调控机制,同时也为农林业鳞翅目害虫的生物防治提供理论依据。调控昆虫翅发育的关键信号通路有Wnt/WingINCB28060分子量less(Wg)、Hippo、Hedgehog(Hh)、Decapentaplegic(Dpp)等信号通路,它们作为形态发生蛋白形成浓度梯度,以浓度依赖的方式诱导信号转导和激活基因表达,进而调控翅的发育。已有研究表明,硫酸肝素蛋白聚糖(Heparan sulphate proteoglycans,HSPGs)在细胞信号传导方面发挥着重要的作用,且保守存在于各类细胞膜表面。硫酸肝素(Heparan sulphate,HS)作为共受体介导多种信号因子的传递,参与组织器官发育和正常生理功能,调控几乎所有器官系统的代谢、运输和信息传递。人类EXT(Exostosin)基因家族中的EXT1、EXT2和EXTL3编码参与合成HS的糖基转移酶,研究发现它们在果蝇中的同源基因tout velu(ttv)、sister of tout velu(sotv)和brother of tout velu(botv)的缺失均会导致果蝇翅缺陷,但其详细的调控机制尚不清楚。为了进一步探究EXT家族在翅发育过程中的作用,我们对鳞翅目模式昆虫——家蚕中的EXT基因进行研究。首先,我们克隆了家蚕的EXT2同源基因Sotv(BmSotv),并对其进行了生物信息学分析和表达特征分析;利用CRISPR/Cas9技术获得了具有明显翅缺陷的BmSotv转基因敲除品系;确定了BmSotv在家蚕翅发育的关键作用时期;并最终通过比较BmSotv敲除突变体和野生型个体的蛋白质组差异和细胞相关实验验证,对翅发育调控机制进行了初步的解析。本研究获得的主要结果如下:1、BmSotv的克隆、鉴定和表达特征分析通过序列比对,BmSotv基因位于家蚕23号染色体,其silk DB3.0数据库编号为BMSK0013095,基因全长5945bp,包含4个外显子,3个内含子。PCR扩增及测序结果显示实验证明其CDS序列全长1638bp,共编码545个氨基酸。对预测的蛋白序列分析发现BmSotv包含3个结构域,包括跨膜结构域、EXT蛋白家族特有的Exostosin结构域和糖基转移酶G64结构域,后两个保守域是合成硫酸肝素所必需的。同源序列比对结果显示BmSotv与EXT2和Sotv蛋白的氨基酸序列相似度在45%。进化分析结果显示家蚕BmSotv与其他鳞翅目昆虫聚为一枝,这表明该基因以及鳞翅目昆虫的同源基因可能是由共同的祖先进化而来,且具有高度的保守性。以上结果暗示序列保守的BmSotv可能参与调控翅发育的功能,是研究昆虫翅膀发育调控的一个重要候选基因。为了探索BmSotv在家蚕中的功能,我们通过q PCR检测BmSotv在家蚕5龄3天幼虫中肠、翅原基、表皮、马氏管、气管丛、精/卵巢、脂肪体、头部和丝腺中的表达情况,结果显示BmSotv在家蚕各组织广泛表达,在中肠表达量最高。为了进一步探索BmSotv在家蚕翅发育过程中的功能,我们对5龄幼虫起至化蛾的翅原基进行了时期表达特征分析,结果显示BmSotv在家蚕5龄幼虫阶段稳定低量表达,在游走期开始表达量上升;对BmSotv进行亚细胞定位,结果显示其主要定位于细胞质和细胞膜。2、BmSotv参与家蚕翅原基的发育利用CRISPR/Chuman biologyas9技术,我们在BmSotv第一个外显子上设计了3条sg RNA,构建了其sg RNA敲除载体;通过胚胎显微注射和荧光筛选获得了sg RNA阳性品系后,将其与Cas9品系杂交,通过荧光筛选获得F1代阳性个体;对F1代阳性个体进行敲除效率检测,结果显示在sg RNA-3品系的基因组敲除位点存在小片段碱基的缺失和单碱基的插入,总体编辑效率达85%,其中70%的碱基缺失会导致移码突变,蛋白翻译提前终止;另外的15%的突变会导致氨基酸减少,从而使BmSotv的表达量降低。与野生型相比,BmSotv-KO品系出现以下表型:(1)蛹期和蛾期翅膀发育畸形,呈现出明显的皱缩和翅面变小;(2)触角和附肢存在不同程度的缺陷,蛹期触角变短且呈竖立状,化蛾后观察到触角上的羽状感受器大量脱落;附肢畸形,严重者蛾子难以实现爬行等活动;(3)在化蛾阶段,统计发现能破茧化蛾的仅占10.47%,其余的84.36%的蛹不能破茧化蛾,将后者蚕茧剪开后,发现其中有71.98%的蛹上半部分蜕皮困难,仅在腹部区域能够蜕去蛹皮,而另外的12.38%的蛹完全无法化蛾;(4)蛾子不能正常交配,无法产生后代。为了进一步探究BmSotv在家蚕翅发育过程中发挥作用的关键时期,我们分别观察了从幼虫的5龄到上蔟化蛹阶段野生型和突变型家蚕的翅原基。结果表明与野生型相比,敲除BmSotv家蚕的翅原基在5龄幼虫仅稍小;但发育到游走期后,可以明显观察到敲除个体翅原基发育出现异常,翅脉发育紊乱无序,翅原基形状远小于野生型。随后,通过RT-PCR检测BmSotv敲除品系和野生型在游走期翅原基中已知与翅发育相关的基因的表达情况,结果显示Wg、Hh、Dpp和Wnt均显著下调。利用Western blot检测BmSotv蛋白和Wnt信号通路中关键蛋白Pangolin的表达水平,发现其表达量均显著下调。以上结果表明BmSotv主要在家蚕游走期参与翅膀的发育,敲除该基因导致翅发育缺陷。BmSotv可能通过调控Wnt和Hh信号通路参与家蚕翅原基的发育。3、BmSotv影响家蚕翅发育的分子机制探究为了探究BmSotv影响家蚕翅发育的分子机制,我们对BmSotv敲除系和野生型游走期的翅原基进行了蛋白质组学测序。差异分析结果表明在敲除组和对照组共有的4113个蛋白中有30个蛋白显著差异表达;在二者各自特异表达的蛋白中有32个显著差异蛋白。我们在转录水平针对筛选出的上、下调蛋白TOP4相对应的基因进行了检测,定量结果与蛋白质组学测序结果一致,表明蛋白质组学测序结果可靠。对以上62个显著差异蛋白进行GO功能分析,结果显示差异蛋白主要在细胞膜上发挥作用,并主要涉及到代谢、催化和结合功能;KEGG富集分析发现差异蛋白主要显著富集到糖胺聚糖生物合成-硫酸角质素(Glycosaminoglycan biosynthesiskeratan sulfate,KS)、溶酶体和Hippo信号通路中。我们利用RT-PCR实验检测KS通路、溶酶体通路中显著差异表达蛋白所对应的基因BMSK0010499和BMSK0005666,定量结果显示均显著上调表达,与组学测序结果一致,说明在家蚕中敲除BmSotv,糖胺聚糖通路发生了显著变化。暗示BmSotv可能Cobimetinib体内与sotv/EXT2相似,作为糖基转移酶参与合成HS。同时,我们检测了Hippo信号通路相关基因BMSK0006876(Dachsous,Ds)、Hippo、Mats和Yki,其中Ds、Hippo和Mats均显示在突变体中显著上调表达,而其负调控基因Yki呈现显著下调,表明敲除BmSotv,显著抑制了Hippo信号通路。此外,我们在细胞水平构建了BmSotv转基因稳定敲除细胞系,基因组检测、免疫荧光和Western blot实验,均表明在突变细胞系中BmSotv被成功敲除,且HS的表达量显著降低。接着,我们在蛋白水平检测了Wnt信号通路中关键蛋白Wnt和Pangolin的表达水平,结果表明其表达量显著下调,这与个体水平得到的结果相符合,由此说明BmSotv也通过Wnt信号通路,参与家蚕翅原基的发育。综上,BmSotv主要在家蚕游走期的翅原基中发挥作用,其参与合成的HS具有与Hippo信号通路中膜受体基因Ds相似的功能,介导Hippo信号通路的转导,从而调控家蚕翅发育;同时,该基因的缺失也会抑制Wnt和Hh信号通路,综合影响进而导致翅原基的发育异常,造成翅呈现皱缩的表型。