目的:研究尿石素A(urolithin A,Uro A)抑制肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)增殖及其初步机制,为防治EV71感染提供新的候选药物,为抗病毒药物研发提供参考。方法:以RD细胞为感染模型进行以下实验。1、Uro A对EV71增殖的影响(1)CCK8(cell counting kit 8,CCK8)检测Uro A对细胞的毒性,筛选最大无毒浓度。(2)通过蛋白免疫印迹phage biocontrol法(western blot,WB)检测Uro A三种给药方式(感染前给药,同时给药和感染后给药)分别对EV71-VP1蛋白表达的影响,筛选有效的给药方式。(3)在Uro A有效给药方式下检测其对EV71增殖的影响:倒置显微镜下观察细胞病变效应(cytopathic cffect,CPE)。通过WB、病毒半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50))、实时GDC-0068体外荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)分别对EV71-VP1蛋白的表达、病毒滴度、病毒复制水平进行检测;同时采用WB、TCID_(50)试验在SK-N-SH细胞中检测Uro A对EV71增殖的影响。2、Uro A抗EV71效果评价(1)细胞毒性评价:通过CCK8和细胞病变抑制试验计算Uro A的半数毒性浓度(half cytotoxic concentration,CC_(50))、半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))和选择指数(selectivity index,SI),了解Uro A对细胞的毒性,同时与广谱抗病毒药物利巴韦林相比较。(2)有效性评价:EV71感染细胞后分别加入Uro A、利巴韦林和药物溶剂,即:Uro A组,利巴韦林组,对照组。(1)WB检测Uro A和利巴韦林对EV71-VP1蛋白表达的影响。(2)剂量依赖实验:WB检测不同浓度Uro A和利巴韦林作用下,EV71-VP1蛋白的表达情况。(3)比较三种尿石素类物质Uro A、Uro B、Uro C对EV71的影响:CCK8试验筛选药物对细胞的最大无毒浓度,通过WB检测EV71-VP1蛋白的表达。3、Uro A抑制EV71增殖的机制探索正常细胞内分别加入药物溶剂、Uro A,EV71感染细胞后分别加入药物溶剂、Uro A,共分为四组,即:空白组,空白加药组,Uro A组,病毒对照组。(1)Uro A对病毒粒子的作用:将Uro A和病毒粒子单独或共孵育1h后感染细胞,WB检测EV71-VP1蛋白的表达。(2)自噬和凋亡的作用:WB检测Uro A作用下自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62的表达和凋亡相关蛋白Caspase-3、Cleaved-caspase-3的表达。结果:1、Uro A对EV71增殖的影响(1)通过CCK8试验,≤50μM的Uro A溶液对RD和SK-N-SH均细胞无明显毒性。(2)比较三种不同的Uro A给药方式,当采用感染后给药时,EV71-VP1蛋白表达明显降低,说明感染后给药是一种有效的给药方式。(3)在Uro A有效给药方式下,在RD细胞中CPE现象明显减少,且存活的细胞状态良好,同时EV71-VP1蛋白表达、病毒滴度及病毒复制水平均明显降低;在SK-N-SH细胞中EV71-VP1蛋白表达和病毒滴度也明显降低。2、Uro A抗EV71效果评价(1)细胞毒性评价:Uro A和利巴韦林的CC_(50)分别为133.415±34.385μM,88.410±18.290μM;IC_(50)分别为6.402±1.231μM,8.922±1.129μM;SI分别为20.840μM,9.910μM。可见Uro A对细胞的毒性作用比利巴韦林小。(2)有效性评价:(1)在RD细胞中Uro A组EV71-VP1蛋白表达低于利巴韦林组,且两组均明显低于对照组;而在SK-N-SH细胞中Uro A组和利巴韦林组EV71-VP1蛋白表达无明显差异,但两组均明显低于对照组。(2)随着Uro A和利巴韦林剂量浓度的加大,Uro A组和利巴韦林组EV71-VP1蛋白表达均下降,且Uro A组的抗病毒效果优于利巴韦林组。(3)Tofacitinib在Uro A、Uro B、Uro C作用下,EV71-VP1蛋白表达均有不同程度的降低。其中,Uro A抑制EV71增殖的效果最好且毒性最小。3、Uro A抑制EV71增殖的机制探索(1)Uro A和病毒粒子单独或共孵育1h后感染细胞,WB检测EV71-VP1蛋白的表达并无差异。(2)与病毒对照组相比,Uro A组中自噬相关蛋白LC3-II表达增加,p62表达降低;凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白表达无明显差异,Cleaved-caspase-3蛋白表达明显升高。结论:Uro A在体外具有良好的抗EV71效果且较利巴韦林的细胞毒性低。Uro A的抗病毒机制可能和诱导细胞自噬和凋亡有关。