革兰氏阴性细菌在细胞结构上与革兰氏阳性细菌的一个显著差别,是其细胞壁的肽聚糖之外还具有一层外膜结构。稳定的外膜结构给selleck化学革兰氏阴性细菌提供了一个稳定的周质空间,从而保证了周质空间中众多重要生命活动的正常进行。在大肠杆菌中,布氏脂蛋白Lpp是最主要的执行稳定外膜结构功能的蛋白之一。Lpp蛋白分子量较小,结构上呈单股α螺旋,常以三聚体形式存在。Lpp也是大肠杆菌中唯一一种能够共价连接到肽聚糖层上的外膜蛋白,其N端连接有三个脂肪酸分子并插Lab Equipment入到外膜中,C端共价连接在细胞壁肽聚糖层上。一个大肠杆菌细胞中含有数十万个Lpp分子,它们共同支撑起外膜,并且保证了外膜结构的稳定性。除此之外,Lpp还参与了周质空间中一系列重要生命活动,如本课题组的前期研究证实,Lpp在大肠杆菌的菌体分裂过程中也起到重要作用。为适应不同的生存环境,自然界中的细菌进化出了不同长度的Lpp。Lpp的长度直接影响到外膜和肽聚糖层之间的距离,进而影响到周质空间的高度。研究表明,延长和截短Lpp蛋白长度之后,大肠杆菌的周质空间的高度就会随之发生变化,周质空间中的一些生命过程也会随之发生变化。如Lpp长度的改变会影响到菌体的机械性质、改变周质空间重要蛋白复合物的装配、影响跨周质空间的信息传递等等。但是关于Lpp的长度改变对细菌生理特征的影响还缺乏系统性研究。本论文在实验室已有工作的基础上,构建了具有不同长度Lpp的大肠杆菌突变株,并且研究了 Lpp长度改变后对大肠杆菌的生理功能的影响,具体研究内容如下:1.构建截短和增长Lpp的大肠杆菌突变株构建了 Lpp截短21个氨基酸残基和增长21个氨基酸残基的大肠杆菌lpp-21和lpp+21突变株。用AlphaFold2对改造后的Lpp进行结构预测,初步判断构建的蛋白能够折叠成为正常的单股α螺旋构象。通过RT-qPCR检测构建的突变基因能够正常转录。提取突变株细胞壁肽聚糖层,使用原子力显微镜研究证实突变后的Lpp蛋白能够正确定位并共价结合到肽聚糖层外侧面上。原子力显微镜下lpp-21突变株肽聚糖层上的Lpp颗粒变小,可能由于Lpp截短之后不易形成三聚体而造成。而且lpp-21突变株肽聚糖层上出现局部缺失Lpp而形成的大量孔洞区域。2.Lpp长度改造Gefitinib分子量后对菌体形态及生长状态的影响以大肠杆菌野生型WT株和缺失Lpp的Δlpp突变株为对照,发现在标准培养条件培养Lpp长度改造后的大肠杆菌lpp-21和lpp+21突变株时,其生长曲线与WT株相似,说明突变株的生长并未受到显著影响。使用光学显微镜、透射电子显微镜、原子力显微镜等对突变株的菌体形貌进行了研究,证实突变株能够正常进行生长分裂,突变株菌体形态并未发生较大改变。但是lpp-21突变株会产生大量菌毛,推测有可能是由于大量菌毛的表达而造成了肽聚糖层上出现缺失Lpp而形成的孔洞结构。3.Lpp长度改造后对突变株生理状态和环境适应的影响Lpp蛋白长度改变后,lpp-21和lpp+21突变株对NaCl浓度的耐受性出现一定程度下降。lpp-21突变株对EDTA的敏感性与WT株相似,但lpp+21突变株对EDTA非常敏感。Lpp长度改变后,两种突变株对高压生长环境的耐受性都出现下降。lpp-21和lpp+21突变株的游动能力和群涌能力都弱于WT株;lpp-21突变株的生物被膜形成能力和WT株相仿,但lpp+21突变株的生物被膜形成能力增强。两种突变株对抗生素的耐受能力与WT株相仿,仅个别抗生素如Fosfomycin对lpp-21突变株的抑菌效果减弱。通过以上研究,揭示了 Lpp蛋白长度改变后对大肠杆菌菌体形貌以及生理功能的影响。本论文的工作有助于深入理解Lpp在维持大肠杆菌生理功能中的意义,并为后续Lpp生理功能的进一步研究提供重要依据。