金黄色葡萄球菌是人畜共患病原体,可导致多种畜禽的皮肤软组织感染、肺炎和乳腺炎等疾病。近年来,随着抗生素的大量应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)的检出率不断增加,表现出多重耐药性,给MRSA感染的临床防治带来极大挑战。更为严重的是,MRSA极易形成生物被膜,不仅增强了对抗菌药物的耐药性,逃避宿主免疫应答反应,且在体内可作为潜在的感染源,释放游离细菌造成慢性感染,反复发作,难以治愈。同时,其诱发产生的持续炎症反应会损害周围的软组织,严重可能导致并发症。因此,开发新型的抗菌药物或治疗策略代替传统抗生素,在清除生物被膜的同时有效缓解炎症,对于临床MRSA生物被膜感染治疗具有重要意义。中药活性成分是新型“替抗”药物研发的重要来源。异甘草素(ISL)是甘草中的查尔酮类活性成分,前期研究发现,异甘草素具有优异的抗菌和抗炎活性,是治疗MRSA感染的潜在药物。然而,异甘草素溶解性差,生物利用度低,且与传统抗生素相比,药效相对较低,限制了其在抗炎及抗菌方面的应用。以纳米制剂为基础的纳米药物递送体系可增加药物溶解度,是实现药物增效减毒,高效利用的有效手段。其中,具有抗菌活性的阳离子纳米载体,不仅可实现抗菌药物的靶向输送,而且可与抗菌药物联合作用,增加抗菌效果。然而,阳离子纳米药物递送体系会与生物被膜中带负电的胞外基质组分相互作用,阻碍其在生物被膜内部的渗透与扩散,无法有效清除生物被膜。鼠李糖脂(RHL)是一种生物相容性好的生物类表面活性剂,能够通过破坏生物被膜胞外基质来分散生物被膜,促进抗菌药物的渗透。综上,本研究选用具有良好生物相容性和生物降解性的天然阳离子多糖壳聚糖纳米粒作为载体担载异甘草素,并通过鼠李糖脂进行修饰,制备担载异甘草素的鼠李糖脂-壳聚糖纳米粒(ISL@RHL-COS),通过体内外试验研究其缓解感染部位炎症,清除MRSA生物被膜,抑制残留细菌再黏附的作用,阐明其作用机制,具体研究结果如下:(1)通过一锅法成功制备了担载异甘草素的鼠李糖脂修饰的壳聚糖纳米粒ISL@RHLCOS,确定了最佳制备条件。制备所得ISL@RHL-COS呈椭圆形,粒径大小为136.7±0.86nm,zeta电位为32±1 m V,异甘草素的包封率与载药量分别为74.9±2.3%和5±0.12%。与壳聚糖纳米粒相比,RHL-COS的稳定性明显增加,并且可实现在酸性环境下响应性的释放异甘草素。(2)ISL@RHL-COS显著增加了ISL的抗MRSA效果,对MRSA的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别降低近4倍和10倍。ISL@RHL-COS可与MRSA发生团聚作用,通过增强细胞膜通透性,破坏细菌细胞膜,降低菌体核酸含量及可溶性蛋白种类和含AMG510作用量等途径,进而影响到细菌DNA复制、转录和翻译过程起到抗MRSA作用。(3)ISL@RHL-COS通过降低胞外基质中胞外多糖与胞外蛋白含量分散生物被膜。通过激光共聚焦定性和活/死染色试验表明,ISL@RHL-COS可有效渗透到生物被膜内部,并杀灭生物被膜内部MRSA。在异甘草素剂量为120μg/m L,ISL@RHL-COS可完全清除生物被膜。(4)通过药物-细菌-细胞互作模型研究了ISL@RHL-COS对细菌进入机体后发生初始黏附的抑制作用。根据细胞存活率和细菌黏附率确定出最佳感染复数为50 MOI。与模型组相比,ISL@RHL-COS在7.5μg/m L时可有效抑制细菌在细胞上发生黏附。(5)ISL@RHL-COS可显著下调LPS诱导的M1型巨噬细胞中促炎因子NO、TNF-α和IL-6水平,证明ISL@RHL-COS具有较高的抗炎能力。(6)建立小鼠皮下脓肿模型ICI 46474 IC50,研究纳米粒体内抗菌试验,结果显示,与ISL和RHL-COS相比,ISL@RHL-COS能有效促进脓肿部位伤口愈合,降低TNF-α和IF-6的含量,并显著降低感染部位MRSA的存活率。此外,成功建立小鼠皮下植入物MRSA生物被膜感染模型,经ISL@RHL-COS治疗后,可高效清除植入的导管表面成熟的生物被膜,有效改善感染组织周围的炎性症状。综上,本论文制备了集“破坏生物被膜-杀灭膜内外细菌-抑制残留细菌再黏附-缓解炎症促组织再生”为一体的多功能纳米体系(ISL@RHL-COS),该纳米体系具有较高的安全性和稳定性,可主动靶向细菌,并p H响应性释放异甘草immediate range of motion素,同时释放的鼠李糖脂可分解生物被膜胞外基质从而促进纳米粒在生物被膜的渗透与扩散,彻底清除生物被膜,并抑制残留细菌再黏附,缓解感染部位炎症,实现安全、高效的MRSA生物被膜感染治疗。本研究针对MRSA生物被膜的耐药机制及生长过程,利用中药单体实现了MRSA生物被膜感染的高效治疗,为中药单体的高效应用提供了新思路,为控制畜禽动物源细菌的耐药性及生物被膜相关的感染问题提供新途径和新方法。