研究背景:1.化疗抵抗是影响胃癌预后的重要原因2020年世界卫生组织发表数据显示:胃癌是世界范围内第五大常见恶性肿瘤和第四大恶性肿瘤相关死亡原因。目前,以化疗为主的综合治疗是主要治疗手段,然而胃癌患者的5年生存率仍低于30%,化疗抵抗可能是重要影响因素。因此,探索化疗抵抗的关键机制,并寻求有效的应对药物是当前工作的重中之重。2.衰老肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)促进胃癌化疗抵抗形成,M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)与免疫抑制和化疗抵抗密切相关CAFs是肿瘤微环境中最主要的基质细胞。研究表明,化疗在杀伤癌细胞的同时,可以引发CAFs发生衰老,所产生的衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)可以促进化疗抵抗的发生。TAMs是肿瘤微环境中重要的免疫细胞,在肿瘤早期以抑瘤作用的M1型为主,中晚期以促瘤作用的M2型为主。最新报道,M2型TAMs具有免疫抑制以及促进化疗抵抗的作用。那么,肿瘤微环境中各种细胞相互作用、互相影响,衰老CAFs是否可以促进TAMs细胞向M2型极化,从而增强免疫抑制?这一问题有待研究。3.扶正解毒方是提高胃癌化疗疗效的有效方剂,其机制需要进一步明确扶正解毒方(后研发为院内扶正解毒口服液)是我院肿瘤科用于治疗胃癌的院内制剂。前期研究显示,扶正解毒方可以增加化疗完成率,使胃癌Ⅲ期患者的5年生存率提高9.1%。另动物实验表明,扶正解毒方联合化疗干预胃癌模型小鼠,治疗效果显著优于单纯化疗组,其机制可能与调控肿瘤微环境中TAMs从M2型向M1型极化,降低免疫抑制因子IL-10、IL-13和TGF-β的表达有关。然而,扶正解毒方是否可以通过调控衰老CAFs改善免疫抑制和化疗抵抗尚待明确。综上,本课题从“胃癌细胞—衰老CAFs细胞—TAMs细胞”入手,探讨衰老CAFs引起免疫抑制和化疗抵抗的新机制,以及扶正解毒方的干预作用,旨在为临床selleck抑制剂上解决胃癌化疗抵抗这一瓶颈问题提供助力。研究目的:1.体外借助衰老CAFs细胞模型,基于p38MAPK/MK2通路和MeCP2/NOX4/PKM2通路,观察衰老CAFs对免疫抑制以及化疗抵抗的促进作用,以及扶正解毒方的干预机制。2.体内借助衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型,验证扶正解毒方通过调控“胃癌细胞—衰老CAFs细胞—TAMs细胞”,改善免疫抑制和化疗抵抗的作用机制。研究方法:1.衰老CAFs高表达SASP及扶正解毒方干预作用研究应用团队前期构建的衰老CAFs模型,采用MRC-5人胚肺成纤维细胞,设置对照组、衰老CAFs模型组、空白血清组、含药血清组,运用ELISA、RT-PCR以及免疫荧光技术,对SASP相关因子—IL-8、TGF-β、WNT16B进行检测,同时观察扶正解毒方含药血清的干预作用。2.衰老 CAFs 条件培养基(conditioned medium,CM)诱导 M2 型 TAMs极化及扶正解毒方干预作用研究运用PMA将THP-1人单核细胞诱导为TAMs细胞;按照团队前期探索的方法提取衰老CAFs的CM,并用其培养TAMs细胞,设置对照组、衰老CAFs-CM组、空白血清组、含药血清组,借助流式细胞术、RT-PCR、免疫荧光技术,检测M2型TAMs细胞标志物CD206的表达水平;同时观察扶正解毒方含药血清对M2型TAMs极化的干预作用;另基于p38MAPK/MK2通路,运用RT-PCR、Western blot方法对作用机制进行探讨。3.衰老CAFs-CM促MKN-45胃癌细胞化疗抵抗及扶正解毒方干预作用研究应用衰老CAFs的CM培养MKN-45胃癌细胞,设置对照组、化疗组、衰老CAFs-CM组、衰老CAFs-CM+化疗组、空白血清组、含药血清组,通过CCK-8法、细胞划痕、平板细胞克隆等实验探讨衰老CAFs-CM对胃癌细胞化疗敏感性的影响;并观察扶正解毒方对衰老CAFs-CM引起化疗抵抗的干预作用。在此基础上,利用RT-PCR、Western blot等方法,基于MeCP2/NOX4/PKM2通路探讨扶正解毒方发挥作用的机制。4.扶正解毒方对衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型干预作用及TAMs调控机制研究采用25只CB17-SCID免疫缺陷小鼠,分别单纯接种胃癌细胞、混合接种衰老CAFs/胃癌细胞,给予5-FU和(或)扶正解毒方进行干预。具体分组为对照组、5-FU组、混合接种组、混合接种+5-FU组、混合接种+5-FU+中药组,干预14天后取材,检测以下指标:(1)小鼠瘤重、瘤体积、抑瘤率;运用RT-PCR、Western blot方法,检测MeCP2/NOX4/PKM2通路的mRNA和蛋白表达水平。(2)运用ELISA、RT-PCR方法,检测小鼠血清和瘤组织中衰老相关分泌因子IL-8、TGF-β、WNT16B的表达水平。(3)运用流式细胞术、免疫荧光方法,检测小鼠脾脏和瘤组织中M2型TAMs表达情况。结合RT-PCR、Western blot方法,检测p38MAPK/MK2通路mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.衰老CAFs高表达SASP及扶正解毒方干预作用研究ELISA、RT-PCR、免疫荧光结果显示:(1)与对照组相比,衰老CAFs组SASP相关因子—IL-8、TGF-β、WNT16B处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs高表达SASP因子。(2)与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以明显抑制衰老CAFs细胞SASP相关因子—TGF-β、WNT16B的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,虽然含药血清组的IL-8表达水平低于空白血清组,但无统计学差异(P>0.05),说明扶正解毒方含药血清可以降低SASP因子的表达水平。2.衰老CAFs-CM诱导M2型TAMs极化及扶正解毒方干预作用研究(1)流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR结果显示:①与对照组相比,衰老CAFs-CM组的M2型TAMs细胞标志物CD206处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs可以诱导TAMs细胞向M2型极化,增强免疫抑制。②与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低CD206的表达水平(P<0.05),逆转TAMs细胞向M2型极化,改善免疫抑制。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低p38MAPK、MK2的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方逆转TAMs细胞向M2型极化,改善免疫抑制的机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。3.衰老CAFs-CM促MKN-45胃癌细胞化疗抵抗及扶正解毒方干预作用研究(1)CCK-8实验、平板细胞克隆形成实验、划痕实验结果显示:①与5-FU组相比,衰老CAFs-CM+5-FU组的肿瘤细胞抑制率明显降低、肿瘤细胞克隆数明显增多、肿瘤细胞迁移率明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs降低了化疗药5-FU的治疗效果,促进了化疗抵抗形成。②与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以提高肿瘤细胞抑制率、减少肿瘤细胞Immune repertoire克隆数、降低肿瘤细胞迁移率,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方可以缓解由衰老CAFs引起的化疗抵抗。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低MeCP2、NOX4、PKM2的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方改善化疗抵抗的机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关。4.扶正解毒方对衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型干预作用及TAMs调控机制研究4.1衰老CAFs对化疗敏感性的影响及扶正解毒方干预作用研究(1)瘤重、瘤体积、抑瘤率结果显示:①相较于单纯接种胃癌细胞各组(对照组、5-FU组),混合接种各组(混合接种组、混合接种+5-FU组)的瘤重、瘤体积明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs具有促瘤作用。②相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”的瘤重、瘤体积明显增大(P<0.05,差异有统计学意义),抑瘤率明显下降,说明衰老CBIBW2992分子式AFs可以引起化疗抵抗。③与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤重和瘤体积明显变小(P<0.05,差异有统计学意义)、抑瘤率显著提高,差异具有统计学意义,提示扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的化疗抵抗。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:相较于“混合接种+5-FU组”,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤组织中MeCP2、NOX4、PKM2表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),从体内印证扶正解毒方改善化疗抵抗的机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关。4.2 SASP相关因子检测及扶正解毒方干预作用研究ELISA和RT-PCR结果显示:(1)在小鼠血清中,相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”TGF-β、IL-8处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在小鼠瘤组织中,相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”IL-8、TGF-β、WNT16B均处于高表达水平(P<0.05),说明联合接种衰老CAFs细胞后,小鼠体内SASP因子处于高表达水平。(2)与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的血清和瘤组织中IL-8、TGF-β、WNT16B的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),说明扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的SASP高表达。4.3 M2型TAMs表达情况及扶正解毒方干预作用研究(1)流式细胞术和免疫荧光结果显示:①相较于单纯接种胃癌细胞组(即对照组、5-FU组),混合接种各组(混合接种组、混合接种+5-FU组、混合接种+5-FU+中药组)小鼠脾脏中CD206的表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明联合接种衰老CAFs细胞后,小鼠体内M2型TAMs细胞表达水平明显升高,增强免疫抑制。②与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的脾脏和瘤组织中CD206明显降低(P<0.05),说明扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:相较于“混合接种+5-FU组”,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤组织中p38MAPK和MK2表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),从体内印证扶正解毒方改善M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制的机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。研究结论:1.衰老CAFs存在衰老相关分泌因子(WNT16B、IL-8、TGF-β)高表达;扶正解毒方可下调衰老相关分泌因子(WNT16B、IL-8、TGF-β)的表达。2.衰老CAFs可以引起TAMs细胞高表达CD206,促进其向M2型TAMs细胞极化,增强免疫抑制;扶正解毒方可降低TAMs细胞CD206的表达水平,改善由衰老CAFs引起的M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制,其机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。3.衰老CAFs可降低胃癌细胞对化疗药物5-FU的治疗效果,促进化疗抵抗形成;扶正解毒方可改善由衰老CAFs引起的胃癌细胞对5-FU的化疗抵抗,其机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关综上,扶正解毒方可以通过对肿瘤微环境中“衰老CAFs-TAMs细胞-胃癌细胞”发挥调控作用,改善免疫抑制以及化疗抵抗。