目的:本文溯源相关古代文献及现代研究,基于“阳化气,阴成形”理论,探讨老年因素体阳虚、阳化气不及、温煦推动不足,致阴性病理产物成形太过,进而蒙蔽清窍发为“呆病”的病机源流,确立“扶阳散凝”法为治疗阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)之根本大法;应用meta分析系统评价温阳疗法治疗AD的疗效及安全性,为“扶阳散凝”治疗AD提供临床证据支持;并采用动物实验,探讨“扶阳散凝”艾灸疗法通过调控AD小鼠脑PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化,促进自噬发生,进而清除Aβ蛋白沉积的作用机制,为临床防治AD提供理论依据。材料与方法:第一部分理论研究:从“阳化气,阴成形”角度认识AD病机的理论探讨 确定检索词为“呆病”、“健忘”、“痴呆”、“癫症”、“阳化气”、“阴成形”等,然后通过在《中华医典》中输入上述检索词进行检索,对搜集到的与AD相关的中医古籍文献进行分类和归纳总结,就祖国传统医学中“阳化气,阴成形”这一经典理论,对古籍文献及近代理论关于AD的论述进行梳理和分析,从阴阳“化气成形”角度探讨AD的病因病机,并进一步提出“扶阳散凝”是治疗AD的根本法则。第二部分:温阳疗法治疗AD的Meta分析 检索中国知网(CNKI)、万方数据库、Cochrane Library数据库参考文献,从建库到2021年9月。2名研究员独立筛选文献,按照温阳治疗思Peptide Synthesis路选择检索词“温阳”、“补阳”、“扶阳”、“艾灸”、“老年痴呆”、“阿尔兹海默症”、“疗效观察”;“warming yang”、“moxibustion”、“Alzheimer’s disease”及“senile dementia”,进行检索。制定文献纳入和排除标准,根据第4版《精神疾病诊断与统计手册》诊断标准,确诊为阿尔兹海默症的患者;纳入采用温阳疗法治疗AD的随机对照试验研究。以简易智能量表(mini-mental state examination,MMSE)、日常生活能力评价量表(activity of daily living scale,ADL)作为评价指标,筛选符合条件的研究。对纳入研究的文献通过Cochrane评测其质量及偏倚风险,并采用Meta分析系统评价温阳治疗AD的疗效及安全性,为“扶阳散凝”治法的提出提供临床证据,且为进一步开展动物实验研究提供依据。第三部分实验研究 实验一:“扶阳散凝”艾灸疗法对AD小鼠认知能力的影响 选用SPF级C57BL/6小鼠70只,雌雄各半,所有小鼠进入实验室适应性喂养1周后,随机选取50只小鼠采用脑立体定位仪下双侧海马注射Aβ_(1-42)寡聚体建立AD动物模型。其余20只小鼠做为假手术组。将造模成功小鼠,随机分为模型组、艾灸组和西药组。假手术组小鼠不做干预。艾灸组小鼠以胶带固定于木板上,用自制艾柱艾灸“关元”,“脾俞”及“百会”,每次3壮/穴,每日1次。模型组和西药组小鼠每日给予同艾灸组相同时间,相同强度的抓取及固定。同时西药组还给予盐酸多奈哌齐(5mg/kg)灌胃,每日1次。每组小鼠均连续干预15天后,采用Morris水迷宫检测小鼠空间学习及记忆能力。行为学检测结束后,小鼠断头取脑以用于病理学检测:用蛋白免疫印迹法及免疫组化法检测各组小鼠海马区Aβ_(1-42)的蛋白表达情况。实验二:“扶阳散凝”艾灸疗法对AD小鼠海马内自噬水平的影响 选用SPF级C57BL/6小鼠66只,雌雄各半,所有小鼠进入实验室适应性喂养1周后,随机选取48只小鼠采用脑立体定位仪下双侧海马注射Aβ_(1-42)寡聚体建立AD动物模型。其余18只小鼠做为假手术组。将造模成功小鼠,随机分为模型组、抑制剂组和艾灸+抑制剂组。假手术组、模型组组干预方法参见实验一。抑制剂组:在模型组干预基础上,每只小鼠腹腔注射3-MA溶液(10mg/kg),每周干预一次,共计3次。艾灸+抑制剂组:在抑制剂组干预基础上,同时每日给予艾灸干预,方法同实验一。各组小鼠连续干预15天后。冰上断头取脑用于检测。透射电镜观察各组小鼠海马内自噬情况;用Western Blot检测各组小鼠海马区自噬Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62相关蛋白表达水平。免疫组化法检测各组小鼠海马区Beclin1、LC3Ⅱ及p62的表达情况。实验三:“扶阳散凝”艾灸疗法调控AD小鼠海马自噬水平作用机制的实验研究 选用SPF级C57BL/6小鼠66只,雌雄各半,所有小鼠进入实验室适应CP-690550溶解度性喂养1周后,随机选取48只小鼠采用脑立体定位仪下双侧海马注射Aβ_(1-42)寡聚体建立AD动物模型。其余18只小鼠做为假手术组。将造模成功小鼠,随机分为模型组、艾灸组和雷帕霉素组。假手术组、模型组及艾灸组干预方法参见实验一Gefitinib-based PROTAC 3价格。雷帕霉素组,在模型组干预基础上,每只小鼠在腹腔注射雷帕霉素(1mg/kg),每日1次。连续干预15天。冰上断头取脑用于检测。透射电镜观察各组小鼠海马内超微结构;Western Blot检测各组小鼠海马区PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR及mTOR蛋白表达水平;免疫组化法检测各组小鼠海马区PI3K、p-AKT及p-mTOR蛋白表达情况。结果:第一部分:理论研究 从“阳化气,阴成形”角度认识AD病机的理论探讨AD归属中医健忘、痴呆、癫狂等范畴,其病性以本虚标实,虚实兼杂为主要特点。古人已经认识到“健忘”与年纪密切相关,随着年龄的增长,阳气逐渐衰退,提出“人年五十以上,阳气始衰,损与日至,心力渐退,忘前失后,兴居怠惰,计授皆不称心”。年老阳气不足,加之社会环境及生活作息的改变等,阳气更虚,“化气”功能衰退,无力温煦推动精血津液的运行,成痰成瘀,导致病理产物“成形”太过,蒙蔽清窍而发病。由此可见,阳虚化气不及是AD发生的根本病机,而阴性病理产物“成形”太过是AD发生的致病因素,即“阳虚阴凝”是AD的发病关键。因此,笔者提出“扶阳散凝”疗法是治疗AD的根本大法。第二部分:温阳疗法治疗AD的Meta分析 共搜集到应用温阳疗法治疗阿尔兹海默症,符合纳入标准的文献8篇,纳入522名AD患者,其中温阳疗法组262例,对照组260例。按照Cochrane的偏倚风险评估准则对所纳入的研究进行偏倚风险评估,表明纳入8篇文献都存在不同程度的偏倚风险,研究质量有待提高。Meta分析显示:其中7篇文献进行了MMSE评分,与对照组相比,温阳疗法组的MMSE量表评分显著提高[MD=1.06,95%CI(0.67,1.46),P<0.01]。有4篇文献对结局疗效进行了总分为56分的ADL量表评价,结果显示温阳疗法组ADL评分明显低于对照组[MD=-5.49,95%CI(-7.34,-3.64,P<0.00001]。且联合应用温阳疗法,有减少西药不良反应的趋势。第三部分:实验研究 实验一:“扶阳散凝”艾灸疗法对AD小鼠认知能力的影响1.行为学检测结果:定位航行试验游泳训练5天,各组小鼠逃避潜伏期均逐渐缩短;第2天开始,与假手术组相比,模型组小鼠的逃逸潜伏期显著延长(P<0.05);从第3天开始,艾灸组小鼠的潜伏期比模型组显著缩短(P<0.05);第5天,与模型组相比,西药组潜伏期明显缩短(P<0.05)。空间探索试验中,模型组小鼠穿越原平台位置次数较假手术组明显减少(P<0.05),而且在目标象限停留的时间显著缩短(P<0.05);与模型组比较,艾灸组及西药组小鼠跨越平台次数较模型组均显著增加(P<0.05);但艾灸组与西药组两组之间比较,艾灸组穿越平台次数增多,趋势更明显(P<0.05)。就目标象限停留时间与模型组比较,艾灸组小鼠目标象限停留时间明显增加(P<0.05);西药组在目标象限停留时间与模型组相比有延长趋势,但无明显统计学差异(P>0.05)。2.蛋白免疫印迹法(Western blot)及免疫组织化学法检测结果显示:与假手术组比较,模型组小鼠海马内Aβ_(1-42)蛋白表达升高(P<0.01),差异有统计学意义;与模型组相比,艾灸组及西药组Aβ_(1-42)蛋白表达下降(P<0.01),差异有统计学意义,与艾灸组比较,西药组海马组织中Aβ_(1-42)的蛋白表达显著升高(P<0.05),有统计学差异。实验二:“扶阳散凝”艾灸疗法对AD小鼠海马内自噬水平的影响1.镜下可见假手术组细胞中神经元线粒体膜结构完好,嵴清晰可见,核内染色质均匀,可见较多自噬体。模型组海马内部分线粒体肿胀变形,核膜双层结构粗糙模糊不清,内嵴断裂变形,少见自噬体;与模型组比较,抑制剂组核膜粗糙更加明显,鲜见自噬体。与抑制剂组相比,艾灸+抑制剂组核膜较平整光滑,胞质内可见较多自噬体。2.Western blot及免疫组化法检测结果显示:与假手术组比较,模型组小鼠海马区Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显减低(P<0.01),p62蛋白表达明显增高(P<0.01),有统计学差异。与模型组比较,抑制剂组小鼠海马区Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均显著下降(P<0.01),p62蛋白表达显著升高(P<0.01),有统计学差异。与抑制剂相比,艾灸+抑制剂组小鼠海马区Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显升高(P均<0.01),而p62蛋白水平有所下降(P均<0.01),差异有统计学意义。实验三:“扶阳散凝”艾灸疗法调控AD小鼠海马自噬水平作用机制的实验研究1.透射电镜检测各组小鼠海马内超微结构:假手术组海马组织可见大量清晰排列的细胞器,适量的自噬体,细胞核膜光滑完整,双层结构清晰,细胞核核内染色质均匀。与假手术组相比,模型组海马组织内细胞器出现变形或萎缩,核膜粗糙不完整,双层结构模糊,自噬体减少。与模型组相比,艾灸组及雷帕霉素组虽仍可见部分不规则变形、萎缩的细胞器,但细胞器增多,核膜较光整,可见较多自噬体。2.Western blot及免疫组化法检测结果显示:与假手术组相比,模型组小鼠海马区中的PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平及p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均显著升高(P<0.01),差异有统计学意义。与模型组相比,艾灸组及雷帕霉素组小鼠海马区PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平及p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。与艾灸组比较,雷帕霉素组小鼠海马区PI3K、p-AKT的表达及p-AKT/AKT的比值均显著降低(P<0.05),差异有统计学意义。结论:1依据古代文献的梳理与总结,AD核心病机为年老阳虚化气功能衰退,病理性阴形凝聚为其重要病理因素,即“阳虚阴凝”为AD发病关键,故提出“扶阳散凝”为治疗AD新思路。2通过对“温阳”疗法治疗AD有效性及安全性的Meta分析及系统评价,发现该疗法能够改善AD患者认知功能及提高生存质量;同时,联合应用温阳疗法还具有减少西药副作用的作用,临床疗效肯定。温阳疗法治疗AD的Meta分析研究为“扶阳散凝”艾灸疗法应用AD治疗提供了文献支撑。3“扶阳散凝”艾灸疗法能够有效改善AD小鼠的认知功能,减少海马区Aβ_(1-42)沉积,提高海马组织中自噬水平。推测其机制可能与激活海马区保护性自噬,发挥减少Aβ_(1-42)沉积,进而改善认知功能作用有关。4“扶阳散凝”艾灸疗法促进AD小鼠海马区保护性自噬水平的深层机制,可能是通过下调过度活化的PI3K/AKT/mTOR信号通路而实现的。以上数据为“扶阳散凝”疗法治疗AD提供了分子水平层面的科学证据。