氮素是影响植物生长发育的主要营养元素之一,对提高作物的产量和品质有极其重要的作用。在农业生产中,增加氮肥施用是作物增产的主要手段,但由于作物对氮肥的吸收利用率低,造成极大一部分未被植物吸收的氮素流失到环境中,引起土壤酸化、水体富营养化等一系列严重的环境污染问题。提高作物氮素利用率selleckchem Canagliflozin是解决这一问题的主要途径,而挖掘更多的氮素调控基因、充实和完善调控氮素的基因网络、解析氮素吸收利用的规律和机制,对于实现农业的高产高效具有十分重要的意义。本研究利用正向遗传学手段克隆出一个新的硝态氮(NO_3~-)调控基因eIF4E1(eukaryotic initiation factor 4E 1),并对其在NO_3~-信号及代谢调控中的功能进行深入、系统的探究,主要研究结果如下:(1)本研究利用拟南芥NO_3~-调控基因突变体筛选系统筛选到一个弱荧光突变体Mut36;通过图位克隆和全基因组测序最终确定目的基因为eIF4E1,该基因编码一个翻译起始因子。等位基因系杂交株系和eIF4E1回补株系的荧光表型进一步明确Mut36突变体的弱荧光表型是由eIF4E1基因突变引起的。NO_3~-处理后突变体中NO_3~-响应基因的诱导表达显著低于野生型。这些结果说明eIF4E1调控植物对NO_3~-信号的响应。(2)对eIF4E1在NO_3~-代谢方面的功能鉴定,发现eif4e1突变体对~(15)NO_3~-的吸收显著低于野生型,且负责NO_3~-转运的NRT1.1(Nitratetransporter 1.1)和NRT1.2基因的表达显著降低,说明eIF4E1能够调控植物对NO_3~-的吸收;另外,与野生型相比,突变体中的硝酸还原酶活性、氨基酸含量均显著升高,且NO_3~-同化基因的表达量也显著升高,说明eIF4E1能够调控植物对NO_3~-的同化过程。这些结果均说明eIF4E1调控植物对NO_3~-的代谢。(3)利用q PCR与GUS染色技术对eIF4E1基因的表达模式进行分析,结果表明eIF4E1在各组织中均有表达,且主要在根、叶和花的维管中表达。通过分析不同氮素条件对eIF4E1表达的影响发现,eIF4E1的表达受到NO_3~-和NH_4~+的诱导,受到氮饥饿的抑制。(4)为进一步解析eIF4E1调控NO_3~-信号的分子机制,对eif4e1突变体进行转录组学测序(RNA-seq)和翻译组学测序(Ribo-seq)。通过对RNA-seq中NO_3~-处理前后野生型和突变体中的差异表达基因进行GO分析,富集到多个与氮相关的clusters,如NO_3~-和氮素化合物的响应及NO_3~-和含氮化合物的转运等,而在这些clusters中也发现多个与NO_3~-响应和代谢相关的基因,说明eIF4E1能够影响下游氮相关基因的表达。对Ribo-seq中NO_3~-处理后eif4e1突变体中有包含NRT1.1在内的多个NO_3~-相关基因的翻译受到影响;进一步多聚核糖体分析结果显示,NO_3~-处理后eif4e1突变体中这些NO_3~-相关基因正在翻译的m RNA量显著低于野生型,这些结果说明eIF4E1能够影响NO_3~-相关基因的翻译,在翻译水平参与NO_3~-信号调控。(5)深入研究eIF4E1与NRT1.1之间的调控关系,发现eIF4E1能够调控NRT1.1的表达,且eif4e1-4 chl1-13双突变体的荧光强度和NO_3~-响应基因表达量均与nrt1.1单突的结果相似。上述结果说明eIF4E1在NO_3~-信号途径中位于NRT1.1上游发挥作用。(6)为了完善eIF4E1调此网站控NO_3~-信号的分子网络,以eIF4E1-BD为诱饵进行了酵母双杂交文库筛选,筛选得到eIF4E1的互作蛋白GEMIN2。酵母双杂交实验、拟南芥原生质体双分子荧光互补实验和GST pull-down实验进一步证明eIF4E1能够与GEMIN2互作,且二者的互作依赖GEMIN2蛋白上的4E-BM基序。为明确GEMIN2是否参与NO_3~-初级响应,对gemin2突变体中NO_3~-响应基因的表达进行检测,结果表明gemin2突变体中NO_3~-响应基因表达量显著低于野生型,说明GEMIN2也能够调控NO_3~-信号,且进一步结果显示GEMIN2和eIF4E1可能位于同一信号通路中发挥作用。(7)通过对eIF4E1过表达株系的表型进行研究,发现在低氮(0.3 m M KNO_3)和高氮(5 m M KNO_3)条件下过表达eIF4E1都能促进拟南芥植株的生长。与野生型相比,过表达株系的主根长度、单株鲜重及株Automated Liquid Handling Systems高均显著增加。对成熟后植株的种子大小、千粒重、单株产量以及氮素利用率(NUE)进行统计后发现,eIF4E1过表达株系中这些指标也均显著高于野生型,说明过表达eIF4E1能显著提高拟南芥的种子产量和NUE。综上所述,本研究克隆到一个新的NO_3~-调控基因eIF4E1,并明确了eIF4E1调控NO_3~-信号转导及代谢的功能及分子机制;首次发现能在翻译水平上调控NO_3~-信号的因子,为今后在翻译水平上研究NO_3~-调控的分子网络奠定基础,为提高作物NUE和培育氮高效作物新品种及实现农业可持续发展提供理论依据和支撑。