新型冠状病毒(Severe acute rSCH727965分子式espiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)是冠状病毒科β冠状病毒属成员,属单股正链RNA病毒,基因组大小为29.9kb,是新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)的病原体。SARS-CoV-2基因组编码28种蛋白质,其中包括4种结构蛋白(刺突蛋白S、包膜蛋白M、膜蛋白N和核衣壳蛋白E),16种非结构蛋白(Nonstructural protein,NSP1-NSP16)和8种辅助蛋白(ORF3a,ORF3b,ORF6,ORF7a,ORF7b,ORF8,ORF9b,ORF14)。COVID-19病死率仅为2.1%,但与2003年流行的SARS相比较,其传播能力更强。SARS-CoV-2的威胁迫在眉睫,其发病机制研究尚存在诸多空白。病毒在进化过程中会有一系列对抗宿主先天免疫反应的策略,利用宿主蛋白对自身进行加工包装以避免被宿主的免疫系统识别清除。木瓜样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)是SARS-CoV-2 NSP3编码的一种半胱氨酸蛋白酶,是病毒复制过程中必须的蛋白水解酶,完成SARS-CoV-2复制所需的NSP1、NSP2和NSP3的释放。先前研究表明,SARS-CoV-2能够通过NSP1、NSP6、NSP12和NSP13等蛋白抑制天然免疫反应,且SARS-CoV中PLpro也能发挥相同的抑制作用,但SARS-CoV-2 PLpro的作用机制不清楚。为阐明SARS-CoV-2PLpro在宿主I型干扰素应答(包括I型干扰素的产生及I型干扰素的信号转导)中的作用,并解析其作用的分子机制,本研究首先将SARS-CoV-2编码的PLpro克隆至真核表达载体pc DNA3.1中,转染HEK-293T细胞,经Western blot检测验证其表达。通过双荧光素酶报告基因检测发现SARS-CoV-2 PLpro能够抑制Poly(I:C)和Se V诱导的IFN-β启动子活性,并且呈剂量依赖性。q RT-PCR检测发现SARS-CoV-2 PLpro能抑制IFN-β等抗病毒因子的表达,ELISA检测结果也表明PLpro可以抑制Se V诱导的A549细胞上清液中IFN-β分泌,提示SARS-CoV-2 PLpro具有抑制I型干扰素分泌的作用。为进一步探究SARS-CoV-2 PLpro干预天然免疫的机制,通过双荧光素酶报告基因和Western blot检测确定PLpro抑制天然免疫信号的作用靶点,Eus-guided biopsy发现PLpro可以促进内源性和外源性MDA5的降解,同时可以抑制IRF3的磷酸化。为探究PLpro表达对MDA5蛋白降解的影响,采用自噬抑制剂或泛素蛋白酶体降解抑制剂后发现,抑制自噬后,PLpro对MDA5的Erdafitinib小鼠降解无显著影响,而使用蛋白酶体抑制剂后,MDA5的表达重新恢复。进而我们检测PLpro对MDA5的K48泛素化水平的影响,结果显示PLpro促进了MDA5的K48泛素化降解。提示PLpro通过泛素化蛋白酶体途径降解MDA5,抑制MDA5对病毒RNA的识别,实现病毒免疫逃逸。同时,使用蛋白酶体降解抑制剂MG132能够提高感染SARSCoV-2细胞的存活率。最后,在探究SARS-CoV-2 PLpro对I型干扰素下游信号转导的影响,我们使用IFN-α激活下游通路,发现SARS-CoV-2 PLpro能够通过抑制STAT1和STAT2的磷酸化来抑制下游信号的转导。综上所述,本研究证明了SARS-CoV-2编码的PLpro能够抑制IRF3磷酸化和促进MDA5泛素化降解抑制IFN-β产生;抑制STAT1和STAT2的磷酸化阻止Ⅰ型干扰素下游信号转导。这些发现进一步加深了对SARS-CoV-2免疫逃逸机制的理解,为了解SARS-CoV-2致病机理提供了理论基础。