犬新孢子虫(Neospora caninum,N.caninum)简称新孢子虫,是一种细胞内寄生性原虫,寄生于哺乳动物的有核细胞,由其引起的新孢子虫病,可造成奶牛及肉牛的繁殖障碍,主要引起孕畜流产。该病呈世界性分布,给养牛业seed infection造成严重经济损失。近年来虽然对新孢子虫病的研究较多,但仍缺乏防治新孢子虫病的特效药及疫苗。因此探究新孢子虫与宿主相互作用的分子机制对于新孢子虫病的防治至关重要。未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是指在感染及其他各种应激条件下,内质网稳态失衡,导致BMN 673生产商错误折叠蛋白增多和钙紊乱导致内质网应激从而引起一系列的信号和转录事件。UPR在不同程度上与天然免疫反应途径相互关联。天然免疫可以通过激活UPR来抵抗部分病毒或细菌的感染。并且UPR在寄生虫感染中同样发挥着重要作用。然而UPR在新孢子虫感染中的作用及分子机制尚未见报道。因此,本研究针对新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PMs)是否引起UPR,以及UPR在新孢子虫感染中的作用及分子机制进行探究,主要内容如下:1、新孢子虫诱导巨噬细胞未折叠蛋白反应的检测(1)UPR诱导剂诱导巨噬细胞未叠蛋白反应检测用不同浓度的UPR诱导剂Thapsigargin(Tg)刺激PMs,通过CCK-8检测细胞活性,Western blot检测UPR指示蛋白BiP(Binding-immunoglobulin protein)蛋白表达水平,筛选诱导剂的最适工作浓度为1μM。(2)新孢子虫诱导巨噬细胞未叠蛋白反应分析用新孢子虫速殖子感染PMs,在不同感染比例以及不同感染时间下,通过Western blot检测BiP蛋白的表达水平。结果显示,新孢子虫感染可以显著上调BiP表达。(3)新孢子虫感染对UPR分支通路激活情况检测分别用新孢子虫与UPR诱导剂Tg刺激PMs,并通过Western blot检测UPR下游分支通路蛋白表达情况。结果表明新孢子虫感染PMs和诱导剂Tg刺激均可引起IRE1α和RERK蛋白磷酸化以及XBP1s蛋白表达显著上调。诱导剂Tg刺激PMs产生ATF6分支通路的活化片段ATF6-n,但在新孢子虫感染下未见ATF6-n。2、未折叠蛋白反应介导新孢子虫激活巨噬细胞NOD2通路的调控作用(1)XBP1s抑制剂的最佳工作浓度分离小鼠腹腔巨噬细胞,分别用不同浓度XBP1s抑制剂STF083010刺激PMs,通过CCK8检测细胞活性,筛选抑制剂STF083010的最佳工作浓度为50μM;Western blot检测P-IRE1α、XBP1s和PPERK蛋白表达水平,结果显示P-IRE1α、XBP1s和P-PERK三种蛋白的表达均被显著抑制。(2)XBP1s对新孢子虫诱导促炎性细胞因子分泌的影响新孢子虫感染STF083010预处理的PMs后,ELISA检测促炎性细胞因子分泌水平。结果显示IL-6、IL-12、TNF-α分泌量显著下降。(3)新孢子虫激活XBP1s调控NOD2信号通路用新孢子虫感染STF083010预处理的PMs,通过Western blot检测NOD2及其下游MAPK、NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示抑制XBP1s后,NOD2、P-p38、P-p65以及P-ERK蛋白水平均显著下调。用新孢子虫感染NOD2的si RNA处理的PMs,ELISA检测促炎性细胞因子的水平;Western blot检BAY 73-4506 IC50测NOD2及其下游MAPK、NF-κB信号通路的表达情况。结果显示干扰NOD2后IL-6、IL-12和TNF-α水平显著下降,P-p38、P-p65以及P-ERK蛋白水平均显著下调。3、未折叠蛋白反应在抗新孢子虫感染中的作用(1)XBP1s对新孢子虫增殖的影响用新孢子虫感染STF083010预处理的PMs,通过qRT-PCR检测虫体数量。结果显示,抑制XBP1s表达后,虫体数量较正常感染组显著升高。(2)NOD2在抗新孢子虫中的作用用新孢子虫感染NOD2的si RNA处理的PMs,qRT-PCR检测虫体数量。结果显示干扰NOD2后导致PMs内的虫体数量显著上升。(3)XBP1s抑制剂STF083010对新孢子虫的影响用STF083010处理新孢子虫,通过姬姆萨染色与显微镜观察检测新孢子虫感染率以及增殖率。结果表明STF083010对新孢子虫的感染与增殖均无影响。(4)XBP1s在新孢子虫感染中的作用用新孢子虫感染XBP1s抑制剂STF083010预处理的6-8周龄C57BL/6小鼠,仅虫体感染组为阳性对照,检测小鼠存活率、减重情况、血清中细胞因子的分泌情况、各器官组织的荷虫量以及病理变化观察。结果表明,与阳性对照组相比,STF083010处理组小鼠死亡时间明显提前,减重明显。心脏、肝脏、脾脏组织中新孢子虫数量显著增多;血清中IL-6、IL-12分泌显著减少;炎性反应减弱。综上所述,本研究发现新孢子虫感染可以引发小鼠腹腔巨噬细胞的UPR反应,并且激活UPR的IRE1与PERK分支。IRE1分支通过XBP1s的激活发挥抗新孢子虫的作用,这种作用通过对NOD2及其下游的NF-κB与MAPK信号通路的调控完成。表明UPR在宿主细胞抗新孢子虫感染中起到重要作用,可作为新孢子虫病药物研发的潜在靶点。