本论文对一种新发现的ArsR/Smt B家族转录因子AcsR(Acidithiobacillus caldus copper-sensitive repressor)进行了表征。acsR操纵子的特征及转录分析,AcsR蛋白性质的测定,铜结合和竞争实验,关键氨基酸定点突变以及凝胶迁移实验提供了A.caldus铜离子耐受性分子层面的见解,并拓宽了对铜离子敏感型ArsR/Smt B家族成员的理解。具体研究内容如下:(1)鉴定了铜胁迫下转录水平明显上调的A.caldus ACAty＿RS15375基因。通过生物信息学的手段分析发现ACAty＿RS15375基因属于ArsR/Smt B家族,与Zn(II)敏感型ArsR/Smt B家族转录因子Smt B~(Se)相比,结合Zn(II)的氨基酸被取代,这意味着它可能不能够结合Zn(II)。确定了acsR基因的潜在启动子为PIII,其荧光强度并且远高于对照组以及其余假定的潜在启动子PI及PII。通过构建p JN19R-promoter-acsR-EGFP质粒,发现在无铜离子的情况下,荧光值被大幅度地抑制,而在铜离子存在的情况下,抑制并没有得到明显的缓解。(2)通过构建重组质粒p ET28a-AcsR,实现了AcsR重组蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性异源表达。重组蛋白以二聚体的形式存在于Tris-HCl溶液中,圆二色光谱数据分析得出AcsR重组蛋白的二级结构为36.5%的α螺旋、17.3%的β折叠、18.6%的β转角及27.6%的无规则卷曲。铜离子滴定实验确定了每分子的AcsR单体能够结合两分子的Cu(I),即每个二聚CX-5461纯度体分子结合四分子的Cu(I)。通selleckchem PF-6463922过与BCA的Cu(I)竞争实验确定了其在BCA体系中K_D值为2.55±0.32×10~(-9)M,说明AcsR对Cu(I)的竞争能力较弱。进行定点突变构建出AcsR C10A、C14A、C62A及C64A突变体。突变体的聚集状态仍然为二聚体的状态,说明单一残基的突变不会影响其空间结构。AcsR C10A、C14A及C62A仍能够结合两分子的Cu(I),而AcsR C64A仅能结合约一分子的Cu(I),说明Cys64残基是AcsR结合Cu(I)的关键氨基酸残基。通过与BCA的Cu(I)竞争实验确定了AcsR C10A、C14A、C62A及C64A突变体在BCA体系中K_D值分别为3.24±0.15,4.17±0.38,3.93±0.27及6.05±0.47×10~(-9) M。(3)验证了AcsR的潜在靶点P2245及P2270DNA片段,结果表明vitamin biosynthesis随着AcsR浓度的增加,DNA-蛋白结合越来越明显。此外,在定量AcsR与DNA的情况下,随着Cu SO_4浓度的增加,DNA-蛋白复合物的量逐渐减少。凝胶迁移实验的结果验证了AcsR作为ArsR/Smt B家族成员的负控调节机制。