N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuramiimmune recoverynic acid,NeuAc)是自然界中最常见的唾液酸(Sialic acids,SAs)家族成员,具有抗癌、抗病毒、促进神经系统和骨骼发育等多种生理功能,被广泛用作药物中间体和营养化学品。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为食品安全级模式菌株,遗传背景清晰,具有成熟的基因操作工具,是生产NeuAc的优良宿主。响应目标产物的生物传感器(biosensor)越来越多地应用于代谢工程改造中,通过筛选高效的途径酶突变体、平衡途径酶表达和合成异质性调控等提高目标产物的合成效率。目前B.subtilis中已报道的响应NeuAc的生物传感器动态范围有限、激活倍数较低,限制了高产NeuAc的酶突变体和B.subtilis重组菌株的筛选。本文首先构建了具有不同NeuAc转运能力的B.subtilis重组菌株,在此基础上设计并构建了可用于B.subtilis中高效响应NeuAc的生物传感器;随后在B.subtilis中引入NeuAc合成途径,并通过随机化N-乙酰神经氨酸合成酶Neu B的核糖体结合位点(RBS)和N-端编码序列(NCS)构建了突变体库,然后结合生物传感器和流式细胞仪,筛选获得了NeuAc产量提高的菌株,证明了构建的响应NeuAc的生物传感器可应用于高产NeuAc菌株的超高通量筛选。主要研究结果如下:(1)构建了具有不同NeuAc转运能力的B.subtilis菌株。首先验证了B.subtilis不具备将胞外NeuAc转运进胞内的能力,于是选取大肠杆菌(Escherichia coli)来源的NeuAc转运蛋白Nan C和NaGefitinib说明书n T,通过外源添加NeuAc的方式测试了它们转运胞外NeuAc的能力,进一步优化了Nan T的表达,从而获得了4株具有不同NeuAc转运能力的菌株BSP1、BSP2、BSP9和BSP7,作为宿主用于响应NeuAc生物传感器的构建。(2)构建了在B.subtilis中可高效响应NeuAc的生物传感器。首先将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)来源Nan R的结合位点插入组成型启动子的不同位置,在不添加NeuAc的条件下筛选具有活性的杂合启动子;接下来引入Nan R,并利用具有不同NeuAc转运能力的B.subtilis选择能响应NeuAc的杂合启动子;最后通过优化Nan R表达量获得了一系列动态范围广、激活倍数高的生物传感器,其中P535-N2具有最广的动态范围,为180–20245 a.u.;P566-N2的激活倍数最高,可达122倍。(3)在B.subtilis中构建了NeuAc合成途径并成功应用生物传感器筛选获得NeuAc产量提高的枯草芽孢杆菌。首先通过启动子和5’UTR替换解除了BCompound C分子式.subtilis内源glm S的反馈抑制;然后引入脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)来源的neu C,敲除与6-磷酸葡萄糖胺(Glc N6P)分解代谢途径相关的基因nag BB、nag BA,最后以p P43NMK质粒为载体,游离表达E.coli来源的Econeu B,成功获得了NeuAc产量为2.02 g·L~(-1)的菌株。利用简并引物随机化p P43NMK质粒上Econeu B的RBS和NCS,构建了大小约为9×10~5的RBS和NCS文库;然后结合生物传感器P535-N2和流式细胞仪最终获得了4株有益突变体,其中BSNB3菌株的NeuAc产量达到3.07 g·L~(-1),较出发菌株提高了52%,证明了此生物传感器在指导枯草芽孢杆菌生产NeuAc中的适用性。