酵母细胞壁(YCW)和核苷酸(NT)是水产养殖中广泛使用的免疫增强剂。在以往的研究中,主要是使用单一的免疫增强剂以增强水产动物的免疫力。但最近的研究表明,两种或多种免疫增强剂的联合使用比单一的免疫增强剂具有更好的协同作用。然而NT和YCW的联合使用对水产动物生长和免疫的影响尚未见报道。因此,本文以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象,分别在个体水平和细胞水平上探讨了NT和YCW及其联合使用对草鱼生长和免疫反应的影响。本研究Preventative medicine的具体内容和研究结果如下:1.核苷酸和酵母细胞壁对草鱼生长、饲料利用和免疫反应的影响通过为期70天的养殖实验,探究饲料核苷酸、酵母细胞壁(含20%β-葡聚糖)及其联合使用对草鱼(初始体重:69.97±0.05 g)生长性能、饲料利用和免疫反应的影响。本研究设计了4种等氮(约38%粗蛋白)等脂(约5%粗脂肪)饲料,以对照组(CD)为基础饲料,分别添加0.01%的NT、0.1%的YCW以及同时添加NT(0.01%)和YCW(0.1%)(NT+YCW)。同时在CD组基础上,添加0.3%的商品料(HP),并用作商品饲料对照组。结果显示,各组草鱼存活率在94.44%-97.78%之间,各组间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,饲喂YCW饲料的鱼的增重率、肌肉粗蛋白含量、血清蛋白、中肠胰蛋白酶和糜蛋白酶活性、血清中溶菌酶和免疫球蛋白M(Ig M)显著升高(P<0.05)。在饲喂NT+YCW饲料的鱼中发现显著最高的增重率、绒毛高度和中肠消化酶活性以及血清中的先天免疫参数(P<0.05)。在饲喂NT+YCW饲料的鱼中上调中肠β-防御素(β-defensin)、铁调素(hepcidin)、白细胞介素10(il-10)和转化生长因子β1(tgf-β1)基因表达,并且在NT+YCW组有最高值。此外,饲喂NT+YCW的鱼肝脏中雷帕霉素样靶标(tor)和核糖体S6蛋白激酶1(s6k1)基因表达显著增加(P<0.05)。同时,中肠白细胞介素(il-1β)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)m RNA水平显著降低(P<0.05)。肝脏组织学结果显示,与对照组相比,饲料中添加NT和/或YCW可以改善肝脏的发育情况。综上所述,饲料NT和YCW联合使用对草鱼的生长、饲料利用、免疫反应以及中肠和肝脏的组织学形态具有显著的协同改善作用。2.草鱼肠道免疫离体研究平台的构建在本研究中,采用组织块培养法培养草鱼肠道原代细胞,并在28℃,含5%CO_2条件下,添加含25 ng/m L重组小鼠生长因子EGF、1m M的MEM非必需氨基酸、100 U/m L的抗生素(青霉素-链霉素)和15%胎牛血清的杜氏改良培养基:Ham's营养素F-12(1:1)(DMEM/F12)、莱博维茨培养基(L-15)和含谷氨酰胺的杜氏改良培养基(DMEM-Gluta MAX(?))中启动草鱼肠道组织的培养。但在实验过程中,使用L-15和DMEM-Gluta MAX(?)培养的肠道组织感染了细菌,因此本文仅使用由DMEM/F12培养基培养的组PF-07321332说明书织所迁出的细胞。在培养的过程中发现,使用DMEM/F12进行传代后的肠道细胞的贴壁和增殖能力较慢,并且不能进行连续的传代。因此又以迁出的第一代肠道细胞为研究对象,分别使用L-15和DMEM-Gluta MAX(?)的完全培养基进行培养并传代,然后观察第二代肠道细胞的贴壁、增殖以及传代情况。结果发现,DMEM-Gluta MAX(?)可以取得较好的培养效果并可以连续传代。目前肠道细胞已经传到第20代。草鱼肠道细胞的成功培养为后续的实验提供了稳定的实验材料。3.核苷酸和β-葡聚糖对草鱼肠道细胞免疫反应、抗氧化和抗凋亡的影响饲养实验结果表明,草鱼免疫力的增强可能是由于NT和β-葡聚糖(BG)的免疫增强作用。因为本文中酵母细胞壁的主要成分是BG。因此为了进selleck CHIR-99021一步探讨NT和BG是否参与免疫反应,本文在细胞水平上研究了NT和BG及其联合使用对草鱼肠道细胞免疫反应、Nrf2/Keap1抗氧化信号通路以及抗凋亡因子相关基因表达的影响。实验分为3部分:第1部分分别设计6个NT浓度(0、10、30、50、70和100μg/m L)和BG浓度(0、10、30、50、70和100μg/m L),处理6和12 h。研究结果表明,在以下实验中选择0、10、50、和100μg/m L的NT和BG,处理时间为6 h,可以满足后续实验需求。第2部分分别设计4个NT浓度(0、10、50和100μg/m L)和BG浓度(0、10、50和100μg/m L),每个处理3个重复,处理6 h。主要研究结果如下:添加10μg/m L NT显著上调草鱼肠道细胞溶菌酶(lysozyme)、il-10和核因子E2相关因子2(nrf2)m RNA表达水平(P<0.05),并且添加10、50和100μg/m L NT均显著上调tnf-α和一氧化氮合酶(inos)基因表达(P<0.05)。添加50μg/m L NT均显著上调鱼肠道细胞过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod1)和tgf-β基因表达(P<0.05),并显著上调nrf2和keap1基因表达(P<0.05)。添加100μg/m L NT对il-10、tgf-β和nrf2表达水平无显著影响(P>0.05),并显著下调lysozyme表达水平(P<0.05)。此外,和对照组相比,添加10和50μg/m L BG均显著上调cat、sod1、tgf-β、il-1β、tnf-α和inos表达水平(P<0.05),并显著上调nrf2和keap1的基因表达水平(P<0.05)。添加100μg/m L BG对il-10、tgf-β、il-1β和tnf-α表达水平无显著影响(P>0.05),并显著下调lysozyme表达水平(P<0.05)。此外,添加50μg/m L NT,10和50μg/m L BG均显著上调抗凋亡因子B细胞淋巴瘤(bcl-xl)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)表达水平(P<0.05)。添加100μg/m L NT和100μg/m L BG对bcl-xl表达水平均无显著影响(P>0.05)。第3部分设计3个BG浓度(0、10和50μg/m L),并在每个水平中添加3个水平的NT(0、10和50μg/m L)(3×3双因素设计),处理6 h。研究结果如下:添加的NT和BG在所有的检测指标之间均存在显著的相互作用(P<0.05)。和对照组相比,单独添加10μg/m L或50μg/m L的NT显著上调cat、sod1、tgf-β、tnf-α、inos、nrf2和keap1基因表达(P<0.05)。单独添加10和50μg/m L BG显著上调cat、sod1、il-1β、tnf-α和inos基因表达(P<0.05),并显著上调nrf2和keap1基因表达(P<0.05)。此外,单独添加50μg/m L NT以及10和50μg/m L BG显著上调bcl-xl和bcl-2基因表达(P<0.05)。50μg/m L NT和50μg/m L BG的联合使用在所有处理中具有最高的免疫、Nrf2/Keap1抗氧化信号通路以及抗凋亡基因表达。由此可见,NT和BG及其联合使用可以提高草鱼肠道细胞免疫反应、Nrf2/Keap1抗氧化信号通路以及抗凋亡因子相关基因表达。综上所述,NT和YCW的联合使用在个体水平和细胞水平均能增强草鱼的生长和免疫反应,并揭示了NT和YCW可能的免疫作用机制,这可以为水产养殖领域寻找合适且有效的免疫增强剂组合以增强其自身的免疫力提供更多的理论依据和学术参考。