过氧化物酶体是植物细胞中负责脂肪酸降解、激素合成、光呼吸、活性氧清除等关键代谢过程的多功能细胞器,在植物的生长发育和抗逆反应中具有重要作用。过氧化物酶体的功能与农作物的产量和抗性密切相关。因此,过氧化物酶体相关研究具有很高的科学意义和农业应用价值。过氧化物酶体的代谢网络复杂,且具有组织和物种特异性,而selleckchem解析过氧化物酶体的蛋白组成是全面认识其代谢功能的前提。基于细胞器分离纯化和质谱检测的蛋白组学分析是系统鉴定过氧化物酶体蛋白的主要手段,不过会严重受限于过氧化物酶体蛋白组成的组织特异性。而通过信号肽直接预测过氧化物酶体蛋白,可有效突破基因表达组织特异性的限制。因此,揭示过氧化物酶体蛋白定位机制和挖掘更多的过氧化物酶体新蛋白有助于全面解析其蛋白组成和代谢网络。另外,前人在拟南芥、大豆、菠菜等双子叶植物中开展了一系列过氧化物酶体蛋白的系统鉴定,但是在单子叶禾本科的模式植物水稻中,过氧化物酶体蛋白的系统研究相对较少。受限于物种特异性,水稻过氧化物酶体的蛋白组成和生理功能均存在大量未知之处。本文首先基于质谱和生信手段,结合亚细胞定位实验,对潜在的植物过氧化物酶体蛋白进行了系统鉴定。一方面,作者从拟南芥绿叶中成功分离纯化过氧化物酶体,并开展蛋白质谱分析,检测到的过氧化物酶体蛋白数量超过以往同类研究,显示出本研究的技术先进性。在此基础上,开展实验确认了At HRBio-active comoundsLP(HEAT Repeat Like Protein)、At GGH2(γ-Glutamyl Hydrolase 2)、At ALDH11A3.4(Aldehyde Dehydrogenase 11A3 isoform 4)、At SDRf(Short-chain Dehydrogenase/Reductase f)、At SDRg、At SDRi、At SDRj、At AAC1(ADP/ATP Carrier 1)和At OEP16-3(Outer Chloroplast Envelope Protein of 16 k Da-3)9个新的过氧化物酶体蛋白。同时,基于针对水稻蛋白的同源性比对分析,开展实验确认了包括Os HRLP、Os OEP16-3L1(OEP16-3 Like 1)、Os OEP16-3L3、Os OEP16-3L4、Os FIS1A(Fission 1A)、Os FIS1B和Os FIS1C在内的7个水稻过氧化物酶体蛋白。其中,OEP16-3、AAC和FIS1等膜蛋白家族不仅定位于过氧化物酶体,也同时定位于线粒体和叶绿体等与过氧化物酶体代谢功能密切相关的能量细胞器,暗示这些蛋白功能与能量细胞器之间的运输和互作有关。另一方面,本文还对水稻蛋白质组开展了生信分析,基于过氧化物酶体I型信号肽PTS1(Peroxisomal Targeting Signal Type 1),在水稻中发现和确认了属于AAE(Acyl-Activating Enzyme)、ATFP(Acyl-Transferase Family Protein)、SDR(Short-Chain Dehydrogenase/Reductase)108E亚家族、GST(Glutathione S-transferase)、HSP(Heat Shock Proteins)和ND(Type II NAD(P)H Dehydrogenases)家族的25个含有PTS1的新过氧化物酶体蛋白,显著拓展了对水稻过氧化物酶体蛋白组成和代谢网络的认识。其次,针对本文过氧化物酶体蛋白系统鉴定中发现的At HRLP和Os HRLP蛋白的特殊定位机制开展了分析。作者发现HRLP是在包括苔藓在内的所有高等有胚植物中保守且特有的过氧化物酶体蛋白。HRLP含有大量成对的螺旋结构,类似负责蛋白间互作的Heat Repeat功能域,因此被命名为HEAT Repeat Like Protein。缺失At HRLP导致拟南芥种子胚胎发育失败,说明其功能重要性。虽然HRLP的C端含有保守且有效的过氧化物酶体信号肽PTS1,但是缺失PTS1并不会影响其过氧化物酶体定位,而且仍然能够回补Athrlp突变体的胚胎发育缺陷。此外,HRLP不含有PTS2(Peroxisomal Targeting Signal type 2),说明HRLP具有已知PTS1和PTS2之外的其他定位信号。为了证明这一点,作者利用酵母系统,创建了酿酒酵母PTS1和PTS2受体蛋白Sc PEX5(Peroxin 5)和Sc PEX7(peroxin 7)的缺失突变体,发现At HRLP在这些酵母突变体中仍然能够定位到过氧化物酶体,充分证明HRLP具有不依赖已知PTS1和PTS2受体的特殊定位机制。最后,本文针对Os HRLP在水稻中的生理作用开展了探究。作者利用基因编辑技术构建Os HRLP功能缺失的水稻突变体,发现与拟南芥的油性种子不同,水稻的典型淀粉种子没有受到HRLP缺失的显著影响。Oshrlp突变体的种子发育、发芽和幼苗形态建成均正常,说明HRLP在淀粉种子发育和发芽中非必需。而水稻Os HRLP基因仍然能回补Athrlp拟南芥突变体的胚胎致死表型,说明虽然HRLP在油性种子和淀粉种子发育中的生理功能显著不同,但是At HRLP和Os HRLP的生化功能是保守的。作者还进一步揭示了Os HRLP在水稻热胁迫响应中具有重要作用,是维持高温下水稻的正常生长和光合作用所必不可少的。热胁迫下,水稻Oshrlp突变体的叶色黄化,其叶绿素含量、净光合速率均显著低于野生型,其胞间CO_2浓度更高,并且其叶绿体中几乎没有淀粉粒的积累,说明其光合作用被显著抑制,以及Os HRLP蛋白和过氧化物酶体在水稻光合作用中具有重要作用。与此同时,水稻Oshrlp突变体中抗氧化物酶活性升高,脂质过氧化产物丙二醛显著积累,说明其活性氧代谢存在异常。此外,本文还对热胁迫下水稻Oshrlp突变体开展了转录组RAD001溶解度分析,发现其过氧化物酶体中的活性氧解毒、β氧化、乙醛酸循环和光呼吸等代谢途径相关基因的表达被显著上调,叶绿素合成和光合作用相关基因表达存在异常,多种碳代谢和氨基酸代谢相关基因显著上调,进一步支持了Os HRLP以及过氧化物酶体在热胁迫下水稻生长和光合作用中的重要性。综上所述,本文利用蛋白质谱分析和生物信息学分析,系统解析了植物过氧化物酶体蛋白质组,并且从中挖掘出大量新的过氧化物酶体蛋白,而且对此前类似研究相对缺乏的水稻过氧化物酶体蛋白组开展了系统分析,为了解过氧化物酶体在作物生产发育中的功能提供了丰富的基因资源。本文还对在高等植物中特异且保守的过氧化物酶体新蛋白HRLP进行了深入分析,发现其存在独特的新型过氧化物酶体定位机制,并且在油性植物种子的发育以及水稻高温下的生长和光合作用中均发挥重要作用,不仅为挖掘更多作物过氧化物酶体蛋白提供了理论基础,还为农业生产上提高油性作物种子质量以及提高作物抗逆性提供了新的研究方向以及重要的基因资源。