研究背景氧化石墨烯(GO)作为新型碳基纳米材料,具有高导电性和高导热性等独特的物理化学性能,在神经医学领域应用广泛。然而研究表明,GO暴露可导致多种类型的神经损伤,但其毒理机制尚不明确。据报道,GO具有较强的促氧化作用,可进入细胞诱导活性氧(ROS)生成,造成细胞内氧化还原失衡,增强细胞内氧化应激水平,导致神经细胞毒性。但是,GO增强细胞内氧化应激水平如何导致神经细胞毒性,有待进一步研究。本研究将深入探讨GO引发的氧化应激反应是否介导线粒体氧化损伤和以及线粒体氧化损伤导致的下游生物效应。研究方法第一章:GO的表征和检测GO的胞内摄取情况及细胞毒性1.扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)观察初始粒径和表面形貌。2.X射线光电子能谱仪(XPS)检测化学键及元素含量。3.动态光散射(DLS)检测水合粒径和Zeta电位。4.CCK-8实验检测细胞活力。5.透射电镜(TEM)观察GO的胞内摄取情况。第二章:GO增强SH-SY5Y细胞氧化应激水平导致线粒体氧化损伤1.免疫荧光(IF)检测GO处理后ROS的变化。2.蛋白免疫印迹实验(WB)检测GO对Trx2、PRDX3表达水平的影响。3.IF检测GO对线粒体活性氧(mtROS)的影响。第三章:GO诱导SH-SY5Y细胞焦亡1.乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测GO处理后LDH的释放。2.IF检测GO处理后碘化丙啶(PI)的表达和分布。3.WB实验检测GO处理后焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1,GSDMD的表达。4.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测GO处理后LY294002临床试验IL-1β、IL-18的表达。第四章:mtROS在GO诱导细胞焦亡的重要作用1.IF检测Mitotempo预处理细胞后,mtROS的表达。2.LDH、IF检测Mitotempo逆转GO对细胞膜完整性的影响。3.WB检测Mitotempo逆转GO对焦亡相关蛋白表达的影响。4.ELISA检测Mitotempo逆转GO对IL-1β、IL-18释放的影响。结果1.GO呈薄片层状,平均粒径在300selleckchem RSL3～800 nm之间,厚度为1 nm,表面具有丰富的含氧基团;在水溶液中平均粒径为741.50±205.40 nm,Zeta电位是-29.40 mV±5.10 nm。2.GO可被细胞摄取;随着GO浓度的增加,SH-SY5Y细胞的存活率显著降低。3.GO导致ROS产生增多,线粒体抗氧化蛋白PRDX3和Trx2表达减少,mtROS大量积累,促进细胞内氧化应激水平进而导致线粒体氧化损伤。4.GO 导致 NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD 表达上调,IL-1β、IL-18 释放增加,诱导细胞焦亡的发生。5.Mitotempo 抑制 mtROS 产生,NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD 表达下调,抑制炎症因子IL-1β、IL-18的释放,缓解细胞焦亡的发生。结论1.GO会对SH-SY5Y细胞造成浓度依赖性的细胞毒性。2.GO导致细胞内ROS累积增强氧化应激水平,抑制PRDX3和Trx2的表达Nucleic Acid Purification Search Tool,促进mtROS生成增多,导致线粒体氧化损伤。3.GO激活NLRP3,促进Caspase-1的级联反应、IL-1β和IL-18释放至胞外,导致细胞焦亡的发生。4.Mitotempo可抑制mtROS的产生,缓解细胞焦亡的发生。