肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,绝大多数原发性肝癌为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。全世界平均每年约有25万人死于肝癌,而我国约占其中的45%。肝癌主要的治疗方法有肝切除、肝移植、靶向治疗、全身免疫治疗、化疗等。但由于癌细胞易产生耐药性,于是寻找新型的化疗药物能够为肝癌的治疗提供更多的选择。华蟾素是传统中药材中华大蟾蜍干皮的提取物,具有抗肿瘤、调节免疫等作用。沙蟾毒精(Arenobufagin)是从华蟾素中提取的活性成分。研究表明沙蟾毒精能诱导肿瘤细胞的凋亡、铁死亡和自噬。铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡形式,是细胞内脂质氧化物代谢异常,细胞内氧化还Whole Genome Sequencing原失衡所致。越来越多的研究发现自噬与铁死亡的关系密切;如核受体辅激活蛋白4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)、RAB7A等调控的自噬依赖性铁死亡。核因子红细胞系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)Telaglenastat抑制剂是细胞内抗氧化的关键调节因子,研究发现p62-Keap1-Nrf2通路在肝癌细胞发生铁死亡过程中起保护作用。p62(也称Sequestosome-1)由SQSTM1基因编码,通过促进Kelch样ECH关联蛋白1(kelch like ECH associated protein 1,Keap1)失活和抑制Nrf2降解使Nrf2核积累增加,同时p62作为与泛素化蛋白和自噬膜蛋白微管相关蛋白1A/1B-轻链3(Autophagy membrane protein microtubule associated protein 1A/1B light chain 3,LC3)的受体,其表达与自噬密切相关。以往的研究对沙蟾毒精诱导的自噬、铁死亡虽然有过阐述,但是自噬和铁死亡的关系尚不清楚。因此,本研究以HepG2细胞和BALB/c Nude小鼠作为研究对象,探究沙蟾毒精诱导肝癌细胞自噬和铁死亡的作用及初步机制。目的本课题旨在通过探讨沙蟾毒精对p62-Keap1-Nrf2通路的影响,初步研究沙蟾毒精诱导的肝癌细胞自噬和铁死亡之间的关系,并明确沙蟾毒精对肝癌细胞的抑制作用。方法通过HepG2细胞构建了肝癌移植瘤模型,记录瘤体大小变化,并通过免疫组化检测增殖转移相关蛋白Ki-67的变化、HE染色观察肿瘤组织的病理学改变;CCK8检测HepG2细胞的增殖能力;透射电子显微镜观察细胞自噬和铁死亡形态学变化;酶标仪检测瘤体组织和细胞中氧化应激指标GSH、MDA、T-SOD的水平变化;流式细胞仪检测HepG2细胞中胞质ROS和脂质ROS水平;Western blot检测移植瘤瘤体中COX-2、Nrf2、Lc3、p62的表达以及HepG2细胞中COX-2、Nrf2、Lc3、p62、Keap-1、HO-1的表达。分别用自噬抑制剂CQ和铁死亡抑制剂DFO(铁螯合剂去铁胺)Colforsin作用预保护再用沙蟾毒精处理HepG2细胞,观察HepG2细胞自噬和铁死亡指标变化。提取核蛋白,检测沙蟾毒精对HepG2细胞Nrf2核转位的影响。通过慢病毒感染构建Nrf2过表达稳转HepG2细胞株,观察沙蟾毒精对Nrf2过表达细胞氧化应激指标以及Nrf2、COX-2、HO-1蛋白表达的影响。结果1.沙蟾毒精抑制移植瘤的生长以5-FU为阳性对照药,与对照组相比,高剂量组沙蟾毒精和5-FU组能够抑制肿瘤生长,中剂量沙蟾毒精能显著抑制肿瘤生长,差异具有统计学意义(P<0.05)。结合HE染色和Ki-67免疫组化结果说明沙蟾毒精能够抑制BALB/c Nude小鼠体内肿瘤的生长。2.沙蟾毒精抑制HepG2细胞增殖以HepG2细胞为研究对象,通过CCK8检测沙蟾毒精对HepG2细胞的细胞增殖具有显著抑制作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.沙蟾毒精诱导HepG2细胞铁死亡Western blot检测沙蟾毒精作用前后BALB/c Nude小鼠移植瘤和HepG2细胞铁死亡相关蛋白Nrf2、COX-2的表达,Nrf2、COX-2的表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化检测小鼠移植瘤ACSL4的表达情况,从蛋白表达层面阐述了沙蟾毒精诱HepG2细胞发生了铁死亡。免疫组化检测还发现沙蟾毒精提高了小鼠移植瘤中4HNE水平,说明沙蟾毒精提高了小鼠移植瘤组织的脂质过氧化水平。接着用流式细胞仪检测发现沙蟾毒精处理后,HepG2细胞ROS和脂质ROS水平并呈剂量依赖性;T-SOD、GSH的含量下降,MDA含量上升,呈剂量依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。透射电镜观察沙蟾毒精作用前后的移植瘤组织和HepG2细胞线粒体的形态学变化。铁死亡诱导剂DFO验证上述结果,发现DFO能够部分逆转沙蟾毒精导致的铁死亡相关蛋白变化和脂质过氧化指标的改变,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.沙蟾毒精诱导HepG2细胞自噬依赖性铁死亡Western blot分别检测沙蟾毒精作用前后移植瘤和HepG2细胞自噬标志蛋白p62和Lc3的表达,p62表达下降,Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ值增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化检测p62的表达,结果表明沙蟾毒精诱导移植瘤细胞和HepG2细胞自噬。同时利用自噬抑制剂CQ对这一结果进行验证,结果显示,CQ部分逆转了沙蟾毒精诱导的HepG2细胞自噬,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时CQ能够部分逆转沙蟾毒精导致的COX-2、Nrf2表达变化和脂质过氧化指标的改变,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明沙蟾毒精诱导HepG2细胞发生自噬依赖性铁死亡。5.Nrf2参与了沙蟾毒精诱导自噬依赖性铁死亡CQ处理的另一结果显示CQ能够部分逆转沙蟾毒精对p62-Keap1-Nrf2通路中Keap1、HO-1的抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),说明沙蟾毒精通过诱导自噬调控p62-Keap1-Nrf2通路;沙蟾毒精处理Nrf2过表达的HepG2细胞,结果显示,沙蟾毒精对Nrf2过表达的HepG2细胞氧化应激影响明显小于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),说明沙蟾毒精通过调控p62-Keap1-Nrf2通路诱导铁死亡。结论沙蟾毒精通过诱导的自噬调控p62-Keap1-Nrf2通路促进了HepG2细胞自噬依赖性铁死亡。