河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是一种毒性极强的生物毒素,1909年被发现于河豚科的河豚种,经研究发现其作用机制为阻滞钠离子通道,从而阻断钠离子内流,使得神经信号无法传导,致使动物感觉神经失能,四肢瘫痪、呼吸困难甚至死亡。但随着后续研究的深入,发现河豚毒素在低剂量时具有良好的镇痛、局麻、戒毒、抗肿瘤等多类功效。其中又以镇痛作用研究最为广泛深入。临床上已有使用河豚毒素与其他镇痛药联用的研究,效果表现良好Crizotinib NMR。微球是一种新型的药物载体,是粒径在微米级的球形粒子,释药时具有明显的缓控释药特性。近年来微球的研究不断深入,越来越多样化的微球类型被开发出来,其制备工艺已相当成熟,微球形态及释放曲线等特性更可通过多种方法进行精准调控,微球已成为当前长缓控释制剂的重要载体。在微球制备材料中,可生物降解型材料一经发现就受到了广泛重视,由于其良好的生物相容性、可控的生物降解性能、对环境友好及成本可控等优点广受关注,其中聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)则是近年来的优秀代表,被美国、中国以及欧盟等地区国家认可,其在人体内完全降解生成对人体无害的二氧化碳和水,具有便于调控的释药速率及释放特性,是一种成熟可靠的微球制备材料。据此,本研究设计并制备了载河豚毒素的PLGA微球,研究内容主要分为以下几部分:首先,本文建立了水溶液及微球中河豚毒素的分析方法,综合尝试考察了反相离子对色谱法、亲水作用色谱法、ELISA试剂盒法及胶体金试剂盒法,最终确定反相离子对色谱法为检测最优解。该方法特异性良好,在1-20μg/m L范围内线性符合测定要求,线性回归方程为A=22216c+591.82(R~2=0.99Fer-1供应商99)。方法学验证结果证明该方法准确度与精密度均良好,RSD均小于2.0%。使用该方法考察了河豚毒素水溶液在37℃,100 rpm振荡条件下的稳定性,结果显示河豚毒素水溶液在该条件下极不稳定,28天降解约74.96±2.93%,为后续研究提供了数据支撑。其次,本文进行了河豚毒素-PLGA微球的处方筛选及表征。采用单因素考察法对微球处方制备工艺进行了最优处方筛选,确定微球最优处方为含5%Na Cl的0.5%PVA外水相,内水相为含100μg TTX的甲酸水溶液,油相为100 mg/m L PLGA的二氯甲烷相,内水相:外水相体积比=0.1:2.5,初乳搅拌速率为8000 rpm,初乳:外水相体积比=2.6:20,复乳搅拌速率为900 rpm。获得最优处方微球包封率为88.56±0.86%,载药量为0.036±0.001%,粒径为111±4.00μm,Span值为0.172。根据扫描电镜照片观察可知所制备微球表面圆整,体外释放特性拟合为一级释放模型,方程为ln(100-Y)=161.53367+0.05061t,相关系数为0.9628,微球14天释放接近90%,21天时浓度已低于方法检测下限。再次,本文进行了河豚毒素-PLGA微球的镇痛药效学考察。以Balb/c小鼠为实验对象,考察了河豚毒素水溶液的最大安全剂量,在此剂量下进行了后续实Subclinical hepatic encephalopathy验考察。建立坐骨神经阻滞模型,以热缩足反射潜伏期(TWL)和机械刺激缩足反射阈值(MWT)为考察指标,采用热板法进行各种制剂作用下小鼠、大鼠的热缩足反射潜伏期(TWL)变化,采用Von Frey纤维丝法考察大鼠的机械刺激缩足反射阈值(MWT)变化,小鼠组热板法结果表明,生理盐水组小鼠前后爪TWL与基础比较并无统计学差异。吗啡水溶液组在0.17 h左右开始起效,小鼠前爪TWL与基础出现显著性差异,后爪TWL增加至大于60 s,0.5 h时到达顶峰,前后爪TWL均增加至超过60 s,然而持续时间较短,2-4 h效果开始衰退,至8 h时恢复至与基础相近水平。河豚毒素水溶液在0.15 h时发挥最强镇痛效果,小鼠前爪TWL由15.32±8.49 s增加到59.43±0.84 s,后爪TWL由21.30±8.85 s增加到55.48±9.03 s,表明河豚毒素水溶液对热板所致的小鼠疼痛有显著的抑制作用,但同样镇痛时间较短,2-4 h效果开始减弱。8h时恢复至基础水平。河豚毒素-PLGA微球组小鼠在给药后,前爪TWL与基础TWL相比变化无统计学差异,而后爪的TWL在2 h时提高至53.21±8.59 s,且在2 h至14天内均保持在较高水平,与基础TWL存在显著差异,在17天时后爪TWL恢复至基础水平,表明药物在2h开始起效,且作用时间长达14天,说明河豚毒素-PLGA微球主要在后爪给药部位发挥局部镇痛作用。说明在此期间对小鼠有显著抑制热痛效果。在大鼠坐骨神经阻滞模型中,热板法测定不同组别热缩足反射潜伏期变化与小鼠表现一致且差异性更为明显,生理盐水组和空白微球组TWL与基础水平无统计学差异,舔前爪TWL为5.17±1.29 s,舔后爪TWL为5.98±1.08 s,吗啡水溶液在0.5 h作用达到顶峰,前爪TWL为7.54±2.66 s,后爪TWL为10.41±1.76 s,前爪与后爪TWL与基础均存在显著性差异,河豚毒素水溶液同样在0.5 h到达顶峰,前爪TWL为7.26±1.01 s,后爪TWL为10.88±1.22 s,与基础相比出现极显著差异,河豚毒素-PLGA微球组前爪TWL在全时间段内与基础无统计学差异,后爪TWL在1 h时开始与基础出现统计学差异,达到8.08±2.00 s,且在1 h至14天内均保持在较高水平,17天检测时后爪TWL恢复至5.41±0.37 s,Von Frey纤维丝法测定结果显示,生理盐水及空白微球对大鼠机械刺激缩足反射阈值无影响,MWT为26 g,吗啡组给药后大鼠后足的机械刺激缩足反射阈值均明显提高,左右后足反应相同,1h时达到最高阈值180 g,2 h后开始下降,在1 d后完全恢复至空白水平,河豚毒素水溶液与吗啡组大鼠阈值变化趋势相同,1h时达到最高阈值180 g,随后开始下降,在1d后完全恢复至空白水平,载药微球组给药后在1 h时左右后足出现差异,左爪作为对照侧阈值无明显变化,而给药侧的右后足阈值开始出现差异性上升,1 h时出现统计学差异,并持续12天,随后开始下降至空白组水平。说明河豚毒素-PLGA微球主要在后爪给药部位发挥局部镇痛作用,具有明显延长河豚毒素镇痛效果的作用。最后,本文建立了生物样本中的河豚毒素含量测定方法,考察了以大鼠为实验对象的河豚毒素水溶液在尾静脉和坐骨神经处给药和河豚毒素-PLGA微球在坐骨神经处给药的药代动力学参数。使用检测方法为LC-MS/MS,采用ESI正离子源,选择甲苯磺丁脲为内标物,河豚毒素和甲苯磺丁脲的检测离子对分别为320.1→301.9(m/z)和271→171.7(m/z),含量测定方法特异性良好,大鼠血浆中的内源性物质与内标物对河豚毒素的检测均无干扰,在1-200 ng/m L浓度范围内线性良好,线性回归方程为Y=0.008338X-0.001664,R~2=0.9991,定量下限(LLOQ)为1 ng/m L,具有良好的准确度和精密度,基质效应和提取回收率良好,可作为河豚毒素在大鼠血浆中的检测方法。使用该检测方法测定河豚毒素水溶液在尾静脉及坐骨神经处和河豚毒素微球在坐骨神经处给药的药时曲线并计算得到药代动力学参数,结果显示,尾静脉注射河豚毒素水溶液半衰期约为19.76±6.58 h,坐骨神经处注射后河豚毒素半衰期为30.38±12.93 h,河豚毒素-PLGA微球坐骨神经处注射河豚毒素半衰期为390.70±137.79 h,河豚毒素微球在给药后检测到河豚毒素浓度在21天内均处于较低浓度,高于检测限但低于或接近最低定量下限。比较坐骨神经处给药TTX水溶液(61.24±12.95 ng/m L*h)与微球组(641.70±169.18 ng/m L*h)的AUC_(0-∞),发现微球组AUC_(0-∞)是TTX水溶液的10倍,但实际给药量为TTX水溶液的40倍,结合河豚毒素-PLGA微球发挥局部镇痛作用来看,可以初步判断河豚毒素-PLGA微球给予大鼠后,释放的河豚毒素集中于局部给药部位。综合结果表明河豚毒素-PLGA微球发挥药效时不存在全身毒性,全血中浓度始终保持在安全剂量范围内。总之,本研究初步证明了所制备的河豚毒素-PLGA微球具有良好的缓释特性,药效学考察实验证明其切实延长了河豚毒素的作用时间,在保证其处于安全浓度范围内发挥了较好的长效镇痛作用。对长效镇痛药的开发和拓展具有一定的指导意义。