烟草是一种在全球广泛种植的特殊经济作物,为国家财政增收和农民致富作出了重大贡献。烟草也是研究和揭示各类生物学现象的模式植物。作为一个生物反应器,烟草还可用于生产次生代谢物、激素、抗体及其他活性物质等。烟碱是烟草中最具生理作用的物质,也是烟草具有商品价值的基础。此外,烟碱也被广泛应用于农业、化工、医药等众多领域。因此,调控烟碱含量对烟草产业的发展和烟碱的多途径利用具有重要意义。杂种优势利用是进行作物遗传育种与性状改良的重要手段之一。课题组前期研究发现烟碱性状具有明显的杂种优势,利用根系转录组分析发现杂交种烟碱合成和转运相关基因都表现为显著的上调表达,推测杂交种的烟碱转运效率也得到了提高。为此,本研究基于烟碱是在根系合成、通过木质部转运到叶片积累的长距离运输次生代谢产物这一特性,将烟株分成根、茎和叶3个部分,采用表CL13900使用方法型、生理、组学及基因功能验证等多种研究方法和技术,对不同优势杂交组合及其亲本材料进行横向与纵向的对比分析,明确了烟碱杂种优势与杂交种烟碱转运效率的关系,揭示了杂交种烟碱转运优势形成的生理与分子机制。取得的主要研究结果如下:1.杂交种间根、茎和叶的烟碱含量差异显著。烟叶烟碱含量与根、茎烟碱含量以及转运系数间呈显著的正相关,相关系数分别为0.5828、0.7743和0.9382;转运系数(TF)对烟叶烟碱含量的直接通径系数最大,为0.8274。杂交种烟叶烟碱含量优势与茎、叶的烟碱含量和转运系数的相关性达到极显著水平,相关系数分别为0.7859、0.9243和0.8444;烟叶烟碱含量和转运系数对烟碱杂种优势的直接通径系数最大,移栽后82 d的通径系数分别达到1.6579和1.0557。烟叶烟碱含量优势与茎秆烟碱含量优势和转运优势的相关性达到极显著水平,相关系数分别为0.6504和0.9Entinostat化学结构474;转运优势对烟叶烟碱杂种优势的直接通径系数最大,为1.0840。结果说明烟叶中烟碱含量杂种优势的形成,是因为杂交种有更强的烟碱合成、转运和积累能力,尤其是杂交种烟碱转运能力的提高。2.不同优势杂交种间的农艺性状差异显著;株高和茎围对烟碱转运能力有显著影响;株高矮、茎围粗,更有利于杂交种烟碱转运能力的提高。杂交种间的茎秆伤流液量、伤流液烟碱含量、迁移烟碱量、水分迁移速率等生理指标存在显著性差异;与烟碱转运系数间呈极显著的正相关,相关系数分别为0.9541、0.8720、0.9402和0.9570;茎秆伤流液的烟碱总量对转运系数的直接通径系数最大,达到3.5988。茎秆伤流液量、伤流液烟碱含量、伤流液烟碱总量、水分迁移速率的杂种优势与烟碱转运优势呈显著或极显著的正相关,相关系数分别为0.9323、0.7564、0.7952和0.9282;其中茎秆伤流液量和烟碱总量的杂种优势对烟碱转运优势的直接通径系数最大。结果说明杂交种烟碱转运能力与烟株的株高、茎围和茎秆的伤流液量、伤流液烟碱含量、伤流液烟碱总量、水分迁移速率有关;株高矮、茎围粗和茎秆中组织液的流动量大、烟碱含量高是杂交种烟碱转运能力强的生理基础。3.杂交种烟碱转运优势的形成主要受基因非加性效应的影响,其中超显性效应占主导作用。超显性表达基因被显著富集到茉莉酸代谢相关通路、药物跨膜转运体活性、跨膜转运活性,以及谷胱甘肽代谢等GO功能条目上。烟碱转运相关的多药外排蛋白、药物代谢转运体、谷胱甘肽S-转移酶,以及ABC家族转运子等基因在杂交种中显著上调表达。综合转录组、蛋白组和酶活性测定结果,发现杂交种中谷胱甘肽S-转移酶(GST,蛋白质登录号:A0A1S3YUL3;基因编号:Nitab4.5＿0000008g0150)基因在不同水平上都呈现显著的上调表达,表明该基因可能是导致杂交种烟碱转运优势形成的主要因子。4.烟草谷胱甘肽S-转移酶家族一共包含59个成员,分为7个亚家族,Nitab4.5＿0000008g0150基因属于烟草GST家族的Tau亚家族第10号成员,本研究将其命名为Nt GSTU10。GSTU10蛋白主要在细胞质和细胞核中发挥作用。Nt GSTU10基因启动子含有大量的激素响应元件、胁迫响应元件、光响应元件以及损伤诱导响应元件等,且对不同胁迫响应模式的分析结果表明Nt GSTU10基因能够增强烟株对温度、干旱、盐、激素和光等胁迫的防御能力。时空表达特异性分析结果显示Nt GSTU10基因在烟株体内的表达水平与烟碱含量和烟碱转运系数间呈极显著正相关关系,推测该基因参与了烟碱的转运代谢过程。5.构建可用于分子对接实验的高质量GSTU10蛋白模板(编号:O49235),其QSQE得分达到0.95,蛋Community-associated infection白模型的GMQE值为0.73,可信度得分为0.74。GSTU10蛋白与烟碱分子(Pub Chem-CID:89594)的最低结合能为-6.64 kcal/mol;烟碱分子主要通过MET67、ARG17、LYS52和ILE53产生的范德华力与GSTU10蛋白相互作用,以及SER66和PRO54产生的氢键力,ASP101和GLU65产生的π键力结合到GSTU10蛋白的活性位点。结果说明GSTU10蛋白能够与烟碱分子相互结合,具有转运烟碱的能力。6.NtGSTU10基因的过表达与敲除突变株在农艺性状上与野生型植株差异不显著。与野生型(Basma)相比,KB32和KB33的烟碱转运系数差异不显著,而OB7和OB12的烟碱转运系数分别提高32.21%和36.47%,差异达到显著水平。与野生型杂交种(V×B)相比,V×KB32与V×KB33的烟碱转运系数和烟碱含量杂种优势差异不显著,而V×OB7和V×OB12的烟碱转运系数分别提高39.50%和40.67%,差异达到显著和极显著水平;烟叶烟碱含量杂种优势值分别提高120.07%和127.59%,差异达到极显著水平。结果说明烟草Nt GSTU10基因能够正向调控烟碱转运优势和烟叶烟碱杂种优势的形成。7.OB12＿vs＿Basma和V×OB12＿vs＿V×B中分别存在1546和5726个差异表达基因(DEGs),有728个DEGs在两个比较组间共同表达。这些DEGs被注释到物质跨膜转运活性、次生物质代谢、对外部刺激的响应、细胞内蛋白质跨膜转运和跨质膜输出等生物学过程;烟碱合成相关的托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成、烟酸和烟酰胺代谢,以及精氨酸和脯氨酸代谢等KEGG通路被显著富集。与烟碱合成相关的AOC、QS、ODC和PAO等基因在杂交组合V×OB12中显著上调表达,烟碱合成相关的负调节因子ERF1、ETR和JAZ等表现为显著的下调表达,与烟碱转运相关的ABCB1、ABCC1、ABCC2和Nt GSTs等基因在V×OB12中显著上调表达。结果表明过表达Nt GSTU10基因能诱导烟碱合成和转运相关基因的正向表达,促进烟碱的合成和转运代谢。因此,本研究认为烟株体内的烟碱首先与GSTU10蛋白发生结合,并被转运至膜上,随后由ABC家族转运蛋白转移至胞外或是液泡中。GSTU10蛋白与ABC型转运蛋白协同作用,使得杂交种中烟碱的结合和转运速率显著高于其亲本自交系,从而导致杂交种烟碱转运优势的产生。综上所述,杂交种烟碱转运能力对烟碱杂种优势的形成有重要影响,株高矮、茎围粗和茎秆中组织液的流动量大、烟碱含量高是杂交种烟碱转运能力强的生理基础。基因及其表达产物的超显性效应在烟叶烟碱杂种优势形成中发挥关键作用。谷胱甘肽S-转移酶(GSTU10蛋白)具有转运烟碱的功能,GSTU10蛋白与ABC型转运蛋白协同作用,增强了杂交种的烟碱转运与合成能力,导致杂交种烟碱转运优势和烟叶烟碱含量杂种优势的产生。研究结果不仅有利于推动烟草烟碱杂种优势的理论研究和杂交种的选育利用,而且对于借助代谢工程和合成生物学方法指导烟碱生产和促进烟碱多途径利用,以及作物杂种优势形成机理的研究也具有十分重要的意义和参考价值。