研究目的:乳腺癌是当前女性群体中发病率、死亡率高,预后较差的恶性肿瘤,化疗是临床乳腺癌常用疗法,但长期以来都面临多药耐药问题。自噬激活导致的凋亡抵抗为多药耐药产生的重要原因之一;此外,乳腺癌微环境中含量丰富的脂肪细胞同样具有激活乳腺癌细胞自噬和增强乳腺癌细胞耐药性的作用。因此,本研究将基于乳腺癌单细胞培养以及乳腺癌细胞与脂肪细胞的共培养模型,研究瑞香狼毒提取物(LD)对乳腺癌细胞自噬相关过程的调控以及多药耐药的影响,同时对相关作用机制进行初步探索。研究方法:针对乳腺癌单细胞模型,采用MTT法检测阿霉素(ADR)和LD对两种乳腺癌化疗敏感细胞株及其对应的阿霉素耐药株存活率的影响,计算IC50及耐药因子;DAPI染色检测LD对耐药细胞凋亡特征的影响;annexin-V-pi双染法检测LD对两乳腺癌耐药细胞株凋亡的影响;western blot检测LD对两乳腺癌耐药细胞株细胞凋亡相关蛋白caspase-8、cleaved caspase-8、caspase-3、cleaved caspase-3 以及自噬相关蛋白mTOR、p-mTOR、p62、LC3表达水平的影响;MDC染色检测LD对耐药细胞自噬小体的影响;LC3免疫荧光检测LD对耐药细胞LC3表达水平的影响;GFP-LC3B-mcherry重组腺病毒转染检测LD对耐药细胞自噬过程的影响;试剂盒检测LD对敏感耐药细胞上清葡萄糖及乳酸、ATP含量的影响;最后采用自噬抑制剂氯喹(CQ)对LD的药效和作用机制进行正向验证。针对脂肪细胞与乳腺癌细胞的共培养模型,采用MTT法检测ADR和LD对乳腺癌敏感及耐药细胞存活率的影响,流式细胞术检测LD对耐药细胞凋亡的影响。Western blot检测LD对敏感及耐药细胞自噬相关蛋白p62、LC3B表达水平的影响;油红O染色检测LD对MDA/ADR细胞脂滴的影响;bodipy荧光与LC3免疫荧光的共定位检测LD对耐药细胞脂滴自噬的影响;试剂盒检测LD对上清乳酸、葡萄糖以及脂肪酸含量的影响;最后,RT-PCR检测LD对共培养体系中脂肪细胞分化标志物FABP4及炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α转录水平的影响。针对乳腺癌移植瘤模型,将乳腺癌耐药细胞接种于裸鼠背部皮下作为对照组,接种于腹股沟脂肪垫作为模型组以模拟脂肪含量丰Trichostatin A核磁富的乳腺微环境,在此基础上通过阿霉素给药研究两移植瘤的耐药性差异,LD给药研究其对两移植瘤的抑制作用,并通过western blot检测肿瘤组织中自噬蛋白LC3、p62的表达水平。研究结果:针对乳腺癌单细胞模型的研究中,MTT结果显示ADR对于两乳腺癌耐药株均具有较高的IC50值,耐药因子分别为58.21和14.20;LD能够显著抑制乳腺癌敏感及耐药细胞的增殖过程,且其作用于两耐药细胞株的IC50值更低,耐药因子分别为0.53和0.51。DAPI染色结果显示,LD能够使耐药细胞出现核变形、裂解等凋亡特征;流式结果显示,各浓度组LD均可显著增高乳腺癌耐药细胞的凋亡比例。Western blot结果显示,LD能够显著提高两乳腺癌耐药株cleaved caspase-3/caspase-3 和 cleaved caSTM2457生产商spase-8/caspase-8 比值;显著降低两细胞 p-mTOR/mTOR比例,上调LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例,升高p62表达水平。MDC染色及LC3免疫荧光结果均显示LD能够使耐药细胞的阳性荧光区域增加。GFP-LC3B-mcherry转染结果显示,LD能够显著增加耐药细胞黄色荧光斑点的数量。上清能量代谢产物检测结果显示,LD能够显著降低两乳腺癌耐药细胞株上清中乳酸及ATP的含量,显著升高上清葡萄糖的含量。CQ的正向验证结果表明,LD与CQ在抑制乳腺癌耐药细胞增殖,调控自噬蛋白p62和LC3表达水平的变化以及促进凋亡均具有相同的作用趋势。针对共培养模型中的研究中,MTT结果显示,过继培养及共培养组乳腺癌敏感及耐药细胞存活率均显著上升,ADR作用后共培养组的存活率显著高于对照组,LD则能够显著降低两模型中乳腺癌细胞的存活率。流式细胞术结果显示,与对照组阿霉素处理后相比,共培养组阿霉素处理后凋亡率显著降低,LD则显著升高模型组乳腺癌细胞的凋亡比例。Western blot结果显示共培养可显著降低敏感及耐药细胞p62的表达水平,升高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值,LD处理后,p62水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值相比对照组显著升高;共培养同时给药的油红O染色结果显示LD能够显著减少乳腺癌耐药细胞中脂滴数目,共培养后给药则显示LD能够显著增加乳腺癌耐药细胞中的脂滴数目。Bodipy与LC3荧光共定位结果显示,与对照组相比共培养组自噬小体和脂滴特异性荧光均显著增强,LD与CQ作用后两种荧光强度均进一步增强。能量代谢检测结果显示,与对照组相比,两乳腺癌细胞模型组上清中的乳酸及脂肪酸含量显著升高,葡萄糖含量显著降低,LD给药组与模型antibiotic residue removal组相比葡萄糖含量均显著升高,乳酸及脂肪酸含量均显著降低。CQ的正向验证结果表明,在共培养体系中LD与CQ在抑制乳腺癌耐药细胞增殖,调控自噬蛋白p62和LC3表达水平的变化以及促进凋亡方面同样均具有相同的作用趋势。最后,RT-PCR结果显示,与乳腺癌耐药细胞共培养的脂肪细胞FABP4表达水平显著降低,LD处理后,与模型组相比FABP4的转录水平有显著回升;共培养后脂肪细胞IL-6、IL-1β和TNF-α转录水平显著升高,LD作用后,各炎性因子转录水平较模型组均显著降低。体内实验结果显示,与对照组相比,模型组移植瘤质量显著增大,对照+ADR组、对照+LD低剂量组、对照+LD高剂量组移植瘤质量显著降低;与模型组相比,模型+ADR、模型+LD低剂量、M+LD高剂量组移植瘤质量均显著降低;与对照+阿霉素组比较,模型+阿霉素组抑瘤率更低。瘤组织的western blot结果显示模型组p62表达水平无显著变化,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著升高,LD则能够显著升高模型组p62表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平。研究结论:综合以上实验结果,我们认为,LD能够通过抑制乳腺癌细胞自噬过程后段自噬小体与溶酶体的结合或溶酶体的酸化过程,导致自噬小体积累,抑制能量代谢,促进凋亡,从而发挥抗耐药作用。而且,LD不仅能够抑制共培养体系中乳腺癌细胞的自噬及能量代谢过程,导致其凋亡;还能够阻止脂肪细胞向CAA的表型转变,减少炎性因子和脂肪因子分泌,从而降低乳腺癌恶性化的风险,通过对共培养体系的整体调节,改善乳腺癌微环境,抑制乳腺癌发生和发展;最后,在裸鼠移植瘤模型中,LD同样能够有效抑制瘤体的生长。LD的以上作用,反映了中医药多靶点、多途径、整体调节的作用特征,说明其具有进一步开发为克服乳腺癌多药耐药的中药新药的潜力。