以孤雌生殖繁殖为主的竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)花芽雄化导致的大面积减产是产业发展急需解决的瓶颈问题。本课题组前期对雌雄花分化关键时期的转录组测序显著富集到细胞分裂素信号转导通路,发现细胞分裂素信号转导通路中的关键成员——细胞分裂素C类调控因子ZaARR24基因在竹叶花椒雄性花芽分化过程中表达量极高,而在雌性花芽中表达量极低,具有非常显著的特异性表达模式。因此,本研究从ZaARR24参与雌雄花分化的调控功能入手,对竹叶花椒雄花分化的内在原因进行解析。首先,结合课题组现有的转录组数据库,以汉源葡萄青椒为研究对象,运用RACE技术克隆ZaARR24的编码序列全长;利用在线生物信息学软件分析核酸和蛋白序列特征;构建荧光蛋白融合载体解析亚细胞定位情况。随后,通过模式植物拟南芥异源过表达和酵母双杂交技术明确ZaARR24调控雌雄蕊分化的基本功能和相互作用蛋白。最后,结合转录组测序、糖类物质和植物内源激素检测,以及6-BA外源处理解析ZaARR24可能涉及的遗传调控通路,从而初步阐明竹叶花椒ZaARR24RSL3溶解度参与雌雄花分化过程的分子机制和候选外源调控因子,为解决竹叶epigenetic drug target花椒花芽雄化问题提供丰富的数据支撑和技术参考。(1)结合RACE技术和参考基因组比对分析,本研究成功克隆ZaARR24基因编码序列全长,共编码125个氨基酸。与已公布的竹叶花椒基因组数据比较,本研究所获ZaARR24序列在第207 bp和第273 bp处存在碱基差异,但蛋白序列完全一致。生物信息学分析结果显示,ZaARR24蛋白序列与芸香科和大戟科亲缘关系相对较近,并在N端第20～120个氨基酸区域含有由3个Motif组成的REC保守结构域。此外,蛋白亚细胞定位结果表明,ZaARR24同时定位于细胞质和细胞核。(2)ZaARR24异源过表达株系的营养生长和生殖生长均受到显著抑制,出现了植株矮小、茎段木质部发育受阻、根系发育受阻等表型变化;同时,在生殖生长方面出现了抽薹和开花时间提前、花量明显减少、花器官整体缩小,果荚长度变短以及部分心皮发育不良等表型特征。此外,花粉活力和交互授粉结果表明,ZaARR24的过表达主要影响花粉发育和雌蕊胚珠的发育过程。(3)12种植物内源激素检测结果显示,ZaARR24过表达株系的细胞分裂素类物质含量整体提高,生长素和茉莉酸含量显著降低。此外,6种糖类物质分析结果表明,ZaARR24过表达显著提高了总糖、还原糖、海藻糖和蔗糖的含量,但淀粉和麦芽糖含量显著降低。同时,野生型和ZaARR24过表达株系花序芽的转录组差异分析结果显著富集于植物内源激素和糖类物质合成通路,且细胞分裂素信号以及淀粉和麦芽糖合成通路极显著下调。上述结果表明,ZaARR24可能通过影响细胞分裂素信号和糖类物质信号调控植物的生殖生长过程。(4)此外,ZaARR24蛋白无自毒和自激活现象。利用高通量酵母双杂筛库分析,共获得65个候选互作蛋白,主要涉及植物花芽性别分化、糖类物质代谢、植物激素信号转导等相关生物学过程。进一步的酵母双杂互作结果显示,ZaARR24与ZaAG存在蛋白相互作用,可用于后续蛋白互作情况分析。(5)结合上述分析结果,本研究进行了不同浓度6-BBelnacasanA处理纯雄株后相关基因的表达模式分析。结果表明,喷施100 mg/L浓度的6-BA对于雄花芽中ZaARR24的诱导效果最为明显,并显著降低了内源细胞分裂素信号转导通路基因的表达;而300mg/L的6-BA显著促进了雄花芽中细胞分裂素合成和信号转导以及淀粉和麦芽糖生物合成通路相关基因的表达水平。