结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,以下简写 M.tuberculosis)是人畜共患结核病的病原菌,给食品安全和人类健康带来持续威胁。红汁乳菇(L actarius hatsudake Tanaka)是一种食药同源的乳菇属大型真菌,含有多糖、甾醇、倍半萜、生物碱等功能成分,具有良好的抗炎、抑菌、抗肿瘤和促进植物生长等生物活性。乳菇紫素是红汁乳菇中一种愈创木烷型倍半萜化合物,课题组前期研究表明乳菇紫素对结核分枝杆菌尤其是耐药结核分枝杆菌具有显著的抑制作用,但其抑制机制尚不清楚。探明乳菇紫素抗结核机制可为从可食资源中CB-839体外挖掘高效抗结核功能成分提供理论依据。本文以M tuberculosis H37Ra为目标菌株,通过反向分子对接技术对红汁乳菇中乳菇紫素的抗结核机制进行预测,结合扫描电子显微镜(SEM)以及透射电子显微镜(TEM)、实时荧光定量PCR技术、label-free蛋白质组学技术以及靶向代谢组学技术对对接结果进行验证。具体研究内容如下:(1)通过分子对接预测乳菇紫素与M.tubercsulosi的82种靶点蛋白之间的结合能,选出排名前三名的蛋白酶。结果显示,排名前三的蛋白酶为环丙烷霉菌酸合酶2(CmaA2)、烯丙酰基载体蛋白还原酶(InhA)以及甲氧基霉菌酸合酶2(MmaA2),结合能大小分别为-9.6、-9.4及-9.4 kcal/mol,表明乳菇紫素可能通过与以上三种蛋白的活性位点相结合从而抑制了M.tuberculosis细胞壁的正常合成。(2)乳菇紫素处理下M tuberculosis H37Ra形貌及超微结构的变化。通过SEM和TEM观察细胞形貌及超微结构发现乳菇紫素能破坏结核分枝杆菌的细胞形态,裂解细胞壁使内容物流出。(3)乳菇紫素处理下M.tuberculosis H37Ra cmaA2、inhA、mmaA2基因的表达量和蛋白质表达的变化。采用实时荧光定量PCR技术,对反向对接结果所得三种酶的编码基因(cmaA2、inhBayesian biostatisticsA、mmaA2)表达量进行了测定。结果显示乳菇紫素能显著下调目的基因的转录水平。采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术对M.tufberculosis H37Ra的蛋白质表达量进行测定,结果显示乳菇紫素可以抑制M.tuberculosis H37Ra的甲基转移酶活性并干扰S-腺苷-L-蛋氨酸的甲基化,阻碍甲基化生物过程。此外,还发现乳菇紫素可以下调CmaA2酶及MmaA2酶的表达量,上调InhA酶的表达量。(4)乳菇紫素处理下M.tuberculosis H37Ra脂肪酸代谢水平的变化。采用气相selleckchem R428色谱-质谱联用(GC-MS)技术对M tuberculosis H37Ra的脂肪酸进行测定,分析乳菇紫素处理下M tuberculosis H37Ra脂肪酸代谢水平的变化。结果显示乳菇紫素可以显著增加M tuberculosis H37Ra中C18、C20及C22脂肪酸,这表明乳菇紫素可以通过抑制CmaA2及MmaA2酶,破坏脂肪酸FAS-Ⅱ系统的进行,阻断分枝菌酸的合成,从而导致C8、C18及C20脂肪酸作为底物则不断产生并积累。