近年来,随着纳米技术的推广,以纳米二氧化硅(Silica nanoparticles,SNPs)为代表的纳米材料在畜牧兽医行业中的开发应用得到飞速发展。SNPs作为载体的一系列纳米制剂,在饲料添加剂、兽药和新型动物疫苗中广泛应用。同时,SNPs与动物的接触途径也逐渐RepSox说明书增多。研究发现SNPs由于粒径小和比表面积大等特殊理化性质,能够穿透血睾屏障(Blood-testis barrier,BTB)而聚集在睾丸中,造成睾丸间质细胞凋亡,导致雄性生殖毒性,影响繁殖能力。本课题组前期研究发现SNPs可导致睾酮分泌量下降,然而,SNPs对于雄性生殖系统的毒副作用还需要进一步确认。因此,本文以小鼠睾丸为主要研究对象,旨在探讨SNPs在生产实践使用中对雄性生殖系统的安全剂量,试验结果如下:(1)在体内试验中,雄性ICR小鼠随机分成对照组、12.5、25和50 mg/mL SNPs组在尾静脉注射处理(仅在第一天处理一次)后分别间隔15、30和60 d,定期检测小鼠体重,观察小鼠行为变化ICI 46474。通过脏器系数检测、H&E和TUNEL染色检测SNPs对小鼠睾丸的毒性损伤。结果显示,与对照组相比,处理15 d后,12.5 mg/mL SNPs处理组睾丸间质细胞凋亡不明显,25和50 mg/mL SNPs随着剂量增加出现越来越明显的胞质固缩呈深色和细胞体积缩小等凋亡现象,且间质细胞逐渐减少,出现明显绿色荧光并呈现剂量依赖性;处理30 d后,12.5 mg/mL SNPs组和25 mg/mL SNPs组无明显病变,50 mg/mL SNPs组仍有间质细胞凋亡及减少的现象,绿色荧光在12.5 mg/mL SNPs组和25 mg/mL SNPs组不明显,在50 mg/mL SNPs组绿色荧光突出;处理60 d后,SNPs组无明显病变特征,且无明显绿色荧光。以上结果表明该SNPs通过尾静脉注射在低剂量(12.5 mg/kg)时对于小鼠睾丸无毒副作用,为安全剂量;高剂量(25和50 mg/kg)在短时间(15和30 d)处理过程中对于睾丸发育具有毒性作用,但随着处理时间增长(60 d)毒副作用变小。(2)在体外试验中,不同浓度的SNPs(100、200、400、600、800、1000和1200μg/mL)处理睾丸间质细胞。通过CCK-8、流式细胞术和Western blot检测SNPs对睾丸间质细胞的毒性作用。CCK-8结果显示,SNPs能够降低睾丸间质细胞的活力并呈现剂量依赖性;流式细胞术结果显示200、400和800 μg/mL SNPs处理后睾丸间质细胞凋亡程度增加,Western blot结果显示,200 μg/mL SNPs组凋亡水平无明显差异,但400和800 μg/mL SNPs组凋亡水平以一定的剂量依赖方式显著增加。以上结果表明该SNPs在低浓度(低于200 μg/mL)剂量时,对体外培养的睾丸间质细胞无毒副作用,但随着浓度的增加显示细胞毒性。在体外试验中,200、400和800 μg/mL SNPs处理睾丸间质细胞,通过MDC法检测间质细胞内的自噬体的变化,Western blot检测自噬相关蛋白的表达情况。MDC结果显示,随着SNPs剂量逐渐增加,自噬空泡在PLCs中的聚集程度逐渐增强,且荧光强度也呈剂量依赖性增强。利用早期自噬抑制剂3-MA、晚期抑制剂CQ和激活剂RAP与SNPs联合作用,用流式细胞术和Western blot检测自噬及凋亡相关蛋白,并对BECLIN-1基因进行敲除后用流式细胞术和Western blot检测自噬及凋亡相关蛋白的表达情况。Western blot结果显示3-MA处理组能够抑制自噬,而凋亡水平显著升高;CQ处理组能够抑制自噬,而凋亡水平显著升高;RAP处理组能够激活自噬,而凋亡水平显著降低。BECLIN-1基因的敲除显著降低了自噬,而增加了凋亡水平。以上结果表明通过激活自噬(使用自噬激活剂)能够有效抑制SNPs诱导的睾丸间质细胞毒性。SNPs通过尾静脉注射在低剂量时对于小鼠睾丸无毒副作用,为Hepatitis Delta Virus安全剂量;高剂量在短时间处理后对于睾丸发育具有毒性作用,但随着处理时间增长毒副作用消失。SNPs在低浓度剂量时对体外培养的睾丸间质细胞无毒副作用,通过添加自噬激活剂能够有效抑制SNPs诱导的睾丸间质细胞毒性。本论文通过对SNPs产生的雄性生殖毒性进行研究,探究SNPs在体与离体的安全剂量与作用时间,对保障畜牧业健康发展具有重要指导意义。