三阴性乳腺癌(TNBEffective Dose to Immune Cells (EDIC)C)是乳腺癌中最具侵袭性、预后最差的一种亚型,其主要特征表现为高概率的远端转移,有20%的TNBC患者在五年内死于转移性疾病进展。研究表明,7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)对TNBC细胞有显著的杀伤能力,并且前期研究发现SN38对TNBC的转移也具备一定的抑制作用。但是SN38的溶解性极差,在体内有效递送和渗透肿瘤组织存在障碍,不能直接应用于临床。通过细胞穿膜肽修饰的两亲性胶束可以有效地改善上述问题,但需要其对肿瘤细胞具有一定的选择性蓄积能力。本研究采用亲水性的聚乙二醇(PEG)与SN38疏水端相连,合成PEG-SN38前药,并选取了细胞穿膜肽TAT修饰PEGSN38,TAT-PEG-SN38在水溶液中自组装形成胶束。TAT-PEG-SN38胶束极大地改善了SN38的水溶性,TAT的引入也增强了胶束对肿瘤细胞的选择性摄取能力和对肿瘤组织的渗透能力,有效抑制了TNBC的肿瘤活性和远端转移。作为新型、高效且安全的抗TNBC药物,具有潜在的临床应用前景,值得作进一步的深入研究。本研究主要包括以下内容:1、TAT-PEG-SN38的合成及表征利用PEG作为linker两端连接TAT和SN38以制备TAT-PEG-SN38。两亲性的TAT-PEG-SN38在水相溶液中可以自组装形成胶束,粒径约为142 nm,电位约为+8.44 m V;通过扫描电镜观察胶束形态为均匀的近球体,胶束溶解性、稳定性良好,粒径、电位适中可以满足体内外药效评价条件。2、TAT-PEG-SN38的体外抗肿瘤效果研究TAT-PEG-SN38对鼠源三阴性乳腺癌细胞系4T1细胞和人源三阴性乳腺癌BT-549具有显著的细胞毒性:对于4T1细胞系,经过TAT的修饰,PEG-SN38的细胞毒性提高了3.61倍;而对于BT-549细胞系,TAT-PEG-SN38组的细胞杀伤效果也明显高于SN38、CPT-11和PEG-SN38。TAT-PEG-SN38对肿瘤细胞的毒性增强是由于细胞穿膜肽修饰改善了PEG-SN3selleck激酶抑制剂8的细胞摄取能力,与PEGSN38相比,4T1和BT-549细胞对TAT-PEG-SN38的细胞摄取强度分别提高了4.2倍和1.7倍。引入正常乳腺上皮细胞HC-11细胞系作为参照分析TAT修饰对肿瘤细胞的选择性,发现TAT-PEG-SN38的摄取与PEG-SN38相比并未有显著增强,可能由于细胞表面电荷差异,TAT-PEG-SN38对肿瘤细胞的内化具有一定的选择性。以3D肿瘤球模型模拟TAT-PEG-SN38的肿瘤穿透能力,孵育24 h后TAT-PEG-SN38渗透进入肿瘤球内部,PEG-SN38仅存在于肿瘤球表面,并且TAT-PEG-SN38明显抑制了肿瘤球的生长。上述实验证明,TAT-PEG-SN38能选择性地被肿瘤细胞摄取,并渗透进入肿瘤内部,具有优越的体外抗肿瘤活性。3、TAT-PEG-SN38的体内抗肿瘤活性评价建立小鼠乳腺癌原位荷瘤模型,对TAT-PEG-SN38的体内抗肿瘤效果进行评价:活体成像结果表明静脉注射胶束8 h后,TAT-PEG-SN38在肿瘤部位有效蓄积,进一步证明TAT能够将药物有效递送到肿瘤区域增强摄取。与Control组相比,TAT-PEG-SN38抑制了52.42%的肿瘤增长,抑制效果是PEG-SN38的1.57倍。通过对肺组织转移情况观察,可以发现TAT-PEG-SN38组对TNBC在体内器官的转移抑制效果明显高于其余给药组。病理性切片分析验证了同样的结果,除TAT-PEG-SN38组外,肿瘤向肝脏和肺脏均出现了不同程度的转移。由此可见,TAT-PEG-SN38明显改善了4T1小鼠荷瘤模型中的器官转移情况。通过免疫组化分析发现,与其他组相比,TAT-PEG-SN38组的抗原CD31的表达量最低,说明TAT-PEG-SN38组可有效抑制肿瘤新生血管的生成。TAT修饰显著提高了PEG-SN38的体内TNBC抗肿瘤效果,抑制了TNBC远端转移。4、TAT-PEG-SN38的抗转移研究首先,在细胞水平考察TAT-PEG-SN38对4T1和BT-549两种细胞系的转移抑制能力:通过细胞划痕愈合和Transwell细胞迁移的研究可以发现,TAT-PEGSN38划痕愈合率分别仅为16.17%、22.19%;,而在Transwell细胞迁移实验中,TAT-PEG-SN38处理组的细胞几乎未发生迁移。和对照组相比,CPT-11并未显著抑制细胞的迁移,TAT-PEG-SN38显著改善了CPT-11的细胞转移抑制能力。通过蛋白质组学对小鼠肿瘤组织的蛋白表达差异分析发现,相比于对照组,TAT-PEG-SN38给药组中有15种蛋白的表达发生了上调,29种蛋白发生了下调,其中与肿瘤转移相关的蛋白中包括DSG2和LDLR、JUP蛋白,并通过Western Blot实验验证了其表达差异,证明了TAT-PEG-SN38对乳腺癌肿瘤的远端转移在蛋白水平产生了影响。根据蛋白质组学分析结果在细胞水平对TAT-PEG-SN3抗TNBC转移进行了验证。选取上调蛋白DSG2和下调蛋白LDLR分别做了基因敲除和过表达质粒,转染上述两种质粒,发现在两种蛋白的表达量逆转后,PEG-SN38和TATPEG-SN38对4T1细胞的迁移抑制能力、肿瘤球杀伤能力显著减弱,这表明DSG2和LDLR两种蛋白可能是SN38对TNBC的转移能力抑制起到了关键性作用。综上所述,Alisertib本研究建立了一种细胞穿膜肽TAT修饰的SN38药物递送策略,改善了难溶性药物SN38的水溶性和细胞摄取能力,体外、体内实验均证明其成功的抑制了三阴性乳腺癌的生长和远端转移,并通过对给药组差异蛋白的分析验证了影响三阴性乳腺癌转移的关键蛋白,使其成为一种易于转化的治疗三阴性乳腺癌的药物递送平台。