CRISPR-Cas系统是原核生物的一种获得性免疫系统,用以抵御噬菌体的入侵。CRISPR-Cas系统依据Cas效应蛋白组成的不同可分为两大类,并进一步分为Ⅰ～Ⅵ六个类型。在这些类型中,Ⅲ型CRISPR-Cas系统因其复杂精密的免疫机制和对入侵者RNA以及DNA的切割而备受关注。Ⅲ型系统识别入侵的RNA分子作为靶标,并进一步分为Ⅲ-A到Ⅲ-F型。Ⅲ型系统的特征是在该基因座上有一个标志性的Cas10蛋白,它可以识别具有错配的protospacer侧翼序列(PFS)的目标RNA,一方面激活核酸酶结构域对非特异性单链DNA进行切割,另一方面产生相应的小分子作为第二信使激发下游的免疫反应。激GSK2118436抑制剂活的前提是:cr RNA的5’端重复区域(称为5’-tag)和target RNA(TR)序列两侧的3’端序列(称为3’anti-tag)是非互补的(称为同源TR,即CTR)。相反,如果这些侧翼序列是互补的(非同源TR,即NTR),则这两种活性都将受到抑制。但Ⅲ型中的Ⅲ-E亚型与常规的Ⅲ型系统存在很大的区别。在该系统中,4个Cas7结构域和一个小亚基(Cas11)融合成一个大的效应蛋白质,命名为g RAMP(giant repeat-associated mysterious protein),它能与caspase样的蛋白酶TPR-CHAT结合形成Craspase(CRISPR-guided caspase)复合物。然而,在本论文的研究之前,该蛋白酶活性还未被证实,Ⅲ-E型系统的免疫机制也仍然是未知的。本文围绕Candidatus“Scalindua brodae”的Ⅲ-E型CRISPR-Cas系统展开研究,首先解析了g RAMP-cr RNA的结构,结构中包含了上文所述的结构域和一个cr RNA分子,但是最后一个Cas7样结构域内的插入结构域(insertion domain)密度较低。对这一插入结构域的功能进行研究,pre-cr RNA的体外加工实验表明插入结构域可能参与了Sb-g RAMP对pre-cr RNA的加工过程。为了解g RAMP-cr RNA如何识别并切割target RNA,解析了g RAMP-cr RNA-TR的结构,在该结构中,TR与cr RNA互补配对形成异二聚体,Cas11结构域提供了一个带正电荷的表面来结合TR。通过对以上两个结构的分析以及体外RNA酶切实验的验证,确定了g RAMP中负责靶RNA位点1和位点2切割的具体氨基酸,即D547负责位点1的切割,D698/D806负责位点2的切割。为了寻找TPR-CHAT的潜在底物,测试了TPR-CHAT基因邻近的蛋白质,在g RAMP和TPR-CHAT所在的基因座上,通常有3个保守的附属基因,分别是csx30、csx31和编码sigma因子E的基因rpoE。体外蛋白酶切割实验证实,Craspase只有在CTR存在的情况下可以切割底物Csx30,但不能切割另外两个附属蛋白。通过质谱分析确定了切割Csx30的具体位点为L407。为研究Craspase的蛋白酶活性是如何由CTR而不是TR或NTR结合激活的,本文还解析了Craspase和Craspase与TR,CTR或NTR结合的复合物的结构。二者的区别是,NTR和CTR的3’anti-tag结合在Craspase的两个不同通道上,具有非互补3’anti-tag的CTR诱导了TPR-CHAT的构象变化,最显著的构象变化发生在TPR结构域的K321-N363区域,这种构象变化激活了TPR-CHAT的蛋白酶活性从而切割Csx30。为了进一Bone quality and biomechanics步研究Csx30切割的生物学意义以及Ⅲ-E型CRISPR-Cas系统的免疫机制,本文发现Csx30可以与Csx31以及Rpo E形成复合物,通过噬菌体侵染实验以及细菌生长曲线测定实验证实了,CTR激活的Csx30的切割触发了细菌的顿挫感染(Abi),并以此作为Ⅲ-E型CRISPR-Cas免疫系统的抗病毒策略。Ⅲselleck合成-E型系统是首个发现的偶联了蛋白酶的CRISPR-Cas免疫系统,展现出巨大的应用潜力。本文的研究为g RAMP的催化机制和Ⅲ-E型系统的免疫机制提供了重要的见解,为未来开发基于Ⅲ-E型系统的RNA编辑和检测工具奠定基础。