目的:探讨缩dysbiotic microbiota泉益肾方通过干预miR-378d抑制KDM6A/KLF10信号轴,干预足细胞EMT,解释其保护足细胞的分子机制研究。方法:1.体内研究:缩泉益肾方(SQYSF)对糖尿病肾病(DKD)小鼠肾脏保护的机制研究,选用db/m小鼠作为阴性对照组(db/m组),自发性2型糖尿病db/db小鼠,适应性喂养2周,随机分为db/db模型组(db/db组)、db/db+缩泉益肾方组(db/db+SQYSF组)及db/db+卡格列净组(db/db+Cana),每组6只,每2周检测小鼠血糖、体重和尿微量白蛋白(m Alb),10周末取材,血液用于检测血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN),肾脏用于苏木精-伊红染色(HE),过碘酸雪夫反应(PAS)、马松三色染色(Masson)观察肾脏组织病理变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肾脏中信号轴KDM6A、KLF10,EMT相关标志物α-SMA、N-cadherin、P-cadherin以及足细胞损害标志因子nephrin mRNA和蛋白表达的影响以及采用RT-qPCR检测肾脏中miR-378d的表达水平。2.体外研究:探讨SQYSF含药血清通过miR-378d抑制KDM6A/KLF10信号轴干预足细胞上皮-间充质转化(EMT)的机制研究。(1)SQYSF含药血清(SQYSF)对高糖(HG)胁迫下足细胞的损伤及EMT相关标志物的干预作用首先,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测SQYSF含药血清中的化合物成分及稳定性;以小鼠足细胞系(MPC-5)为研究对象,HG胁迫后,给予SQYSF含药血清(低中高剂量)和Cana干预,采用CCK-8实验、细胞划痕实验、流式细胞术及细胞形态实验,分别检测各组足细胞的活力、迁移力、凋亡率以及足细胞的形态改变;RT-qPCR和Western blot检测足细胞中信号轴KDM6A、KLF10,EMT相关标志物α-SMA、N-cadherin、P-cadherin以及足细胞损害标志因子nephrin mRNA和蛋白表达的影响;RT-qPCR检测miR-378d的表达水平。(2)SQYSF抑制KDM6A/KLF10信号轴干预足细胞EMT的机制作用HG胁迫足细胞后,给予KDM6A抑制剂GSK-J4和SQYSF含药血清干预,采用CCK-8实验和流式细胞术,分别检测各组足细胞的活力和凋亡率;RT-qPCR和Western blot检测足细胞中信号轴KDM6A、KLF10,EMT相关标志物α-SMA、N-cadherin、P-cadherin以及足细胞损伤标志因子nephrin mRNA和蛋白表达的影响。(3)SQYSF通过miR-378d抑制KDM6A/KLF10信号轴干预足细胞EMT的作用机制利用双荧光素酶报告基因检测miR-378d与靶基因DKM6A是否有结合位点后,构建足细胞瞬时转染miR-378d(miR-378d mimic NC、miR-378d mimic或miR-378d inhibitor NC、miR-378d inhibitor),同时给予HG或SQYSF含药血清干预,采用CCK-8实验和流式细胞术,分别检测各组足细胞的活力和凋亡率;RT-qPCR和Western blot检测各组足细胞中信号轴KDM6A、KLF10,EMT相关标志物α-SMA、N-cadherin、P-cadherin以及足细胞损害标志因子nephrin mRNA和蛋白表达的影响。结果:1.体内研究小鼠生理指标及肾脏形态:经SQYSF和Cana治疗后,db/db+SQYSF组和db/db+Cana组较db/db组小鼠第4周后血糖明显降低(P<0.01),但小鼠体重无明显降低的改变;db/db+SQYSF组和db/db+Cana组较db/db组小鼠肾脏水肿和肥大的情况显著得到改善,肾脏表面光泽度不同程度的恢复;小鼠肾功能检测:db/db组小鼠在造膜第2周起m Alb明显升高(P<0.01),经SQYSF和Cana治疗后,db/db+SQYSF组和db/db+Cana组小鼠m Alb在第4周明显降低(P<0.05),但第6周有所升高,第8周后m Alb降低(P<0.01);血液中db/db组小鼠Scr、BUN明显升高(P<0.01),db/db+SQYSF组和db/db+Cana组较db/db组小鼠Scr、BUN明显降低(P<0.01);肾脏病理染色:HE染色结果显示,db/db组小鼠肾脏组织肾小球整体形态增大,出现明显系膜增生,SQYSF组与Cana组小鼠肾脏肾小球整体形态明显改善,并不同程度缓解肾小球系膜增生;PAS染色结果显示,db/db组小鼠肾小球糖原沉积增加,基底膜增生,系膜基质沉积,db/db+SQYSF和db/db+Cana组糖原沉积明显减少,肾小球基底膜增生和系膜基质沉积明显减轻;Masson染色结果显示,db/db组小鼠肾小球胶原纤维和肌纤维明显沉积;db/db+SQYSF组和db/db+Cana组小鼠肾小球胶原纤维和肌纤维明显沉积减少,db/db+SQYSF组和db/db+Cana组小鼠肾脏肾间质胶原成分聚积的情况减轻,肾脏纤维化的情况得到一定的改善;RT-qPCR和Western blot结果显示,db/db组小鼠肾脏中KDM6A、KLF10、α-SMA、N-cadherin mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01),P-cadherin、nephrin mRNA和蛋白表达降低(P<0.05、P<0.01),db/db+SQYSF组和db/db+Cana组小鼠肾脏中KDM6A、KLF10、α-SMA、N-cadherin mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),P-cadherin、nephrin mRNA和蛋白表达不同程度升高(P<0.01),db/db+SQYSF组小鼠肾脏中P-cadherin mRNA表达水平变化无统计学意义(P>0.05)。2.体外研究(1)SQYSF含药血清对高糖(HG)胁迫下足细胞的损伤及EMT相关标志物的干预作用:HPLC-MS分析结果显示,SQYSF含药血清样品质谱峰保留时间和信号强度稳定,含有多种有效成分;CCK-8实验结果显示,SQYSF-L组、SQYSF-M组和Cana组较HG组足细胞活力明显升高(P<0.01),SQYSF-H组细胞活力较HG组降低,其中SQYSF-M组细胞活力升高最明显;划痕实验结果显示,SQYSF-L、SQYSF-M、SQYSF-H和Cana组较HG组足细胞划痕宽度明显缩小,足细胞迁移力增强(P<0.01),SQYSF-M组足细胞迁移力增强最明显;流式细胞术结果显示,SQYSF-L、SQYSF-M、SQYSF-H组和Cana组较HG组细胞凋亡率明显降低(P<0.01),SQYSF-M组足细胞的凋亡率降低最明显;细胞形态观察结果显示,正常情况下,足细胞呈长梭形、胞体形状清晰,伴不规则的树枝样分支足突,自胞体处伸出,使细胞间形成连接,当HG胁迫后24h后,足细胞胞体与足突连接处模糊,足突减少回缩,细胞形态明显得到改善,足突结构较清晰及数量增加,细胞间的连接度增强;RT-qPCR和Western blot结果显示,HG组KDM6A、KLF10、α-SMA、N-cadherin mRNA和蛋白表达升高(P<0.01),P-cadherin和nephrin mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),P-cadherin mRNA表达水平变化无统计学意义(P>0.05),SQYSF组与Cana组KDM6A、KLF10、α-SMA、N-cadherin mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),P-cadherin和nephrin mRNA和蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),Cana组P-cadherin mRNA表达水平变化无统计学意义(P>0.05)。(2)SQYSF含药血清通过抑制KDM6A/KLF10信号轴干预足细胞EMT的作用机制:CCK-8实验结果显示,HG组足细胞活力较N组明显降低(P<0.01),GSK-J4组和SQYSF组足细胞活力明显升高(P<0.01);流式细胞术结果显示,HG组足细胞凋亡率明显升高(P<0.01),SQYSF组和GSK-J4组足细胞凋亡率明显降低(P<0.01);RT-qPCR和Western blot结果显示,HG组KDM6A、KLF10、α-SMA、N-cadherin mRNA和蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05),P-cadherin mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),nephrin蛋白表达降低(P<0.01),SQYSF组和GSK-J4组KDM6A、KLF10、α-SMA、N-cadherin mKPT-330 IC50RNA表达水平明显下降(P<0.01),其中,GSK-J4组KLF10蛋白表达变化无统计学意义(P>0.05),P-cadherin mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01),nephrin蛋白表达明显升高(P<0.01)。(3)SQYSF含药血清通过miR-378d抑制KDM6A/KLF10信号轴干预足细胞EMT的作用机制:双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-378d与KDM6A3'-UTR具有结合位点。RT-qPCR结果显示,HG组miR-378d的表达明显降低(P<0.01),SQYSF组miR-378d的表达明显升高(P<0.01)。为验证为验证miR-378d在DKD中的作用,本研究采用了瞬时转染miR-378d mimic和miR-378d inhibitor。RT-qPCR结果显示,miR-378d mimic NC组和miR-378d inhibitor NC组较N组miR-378d的表达差异无统计学意义(P>0.05),miR-378d mimic组miR-378d的表达变化无统计学意义(P>0.05),miR-378d inhibitor组较N组miR-378d的表达明显降低(P<0.01),视为miR-378d转染成功;CCK-8实验结果显示,HG+miR-378d mimic NC组足细胞活力较miR-378d mimic NC明显降低(P<0.01),HG+miR-378d mimic组足细胞活力明显升高(P<0.01),miR-378d inhibitor组足细胞活力较miR-378d inhibitor NC组明显降低(P<0.01),SQYSF干预后足细胞活力明显升高(P<0.01);流式细胞术结果显示,HG+miR-378d mimic NC组足细胞凋亡率较miR-378d mimic NC明显升高(P<0.01),HG+miR-378d mimic组足细胞凋亡率明显降低(P<0.01),miR-378d inhibitor组足细胞凋亡率较miR-378d inhibitor NC明显升高(P<0.0Decitabine说明书1),SQYSF干预后足细胞凋亡率明显降低(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与miR-378d mimic NC比较,HG+miR-378d mimic NC组KDM6A、KLF10和N-cadherin mRNA表达水平明显升高(P<0.01),但N-cadherin mRNA表达水平变化无统计学意义(P>0.05),P-cadherin mRNA表达水平明显降低(P<0.01),HG+miR-378d mimic组KDM6A、KLF10、α-SMA、N-cadherin mRNA表达水平明显降低(P<0.01),nephrin mRNA表达水平明显升高(P<0.01),与miR-378d inhibitor NC组比较,miR-378d inhibitor组KLF10 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),KDM6A和N-cadherin mRNA表达水平变化无统计学意义(P>0.05),P-cadherin mRNA表达水平明显降低(P<0.01),SQYSF组KDM6A、KLF10、α-SMA和N-cadherin mRNA表达水平明显降低(P<0.01),P-cadherin mRAN表达水平明显升高(P<0.01);Western blot结果显示,N组与miR-378d mimic NC组KDM6A蛋白表达无差异,miR-378d mimic组KDM6A蛋白表达明显被抑制(P<0.01),N组与miR-378d inhibitor NC组KDM6A蛋白表达无明显被促进,miR-378d inhibitor组KDM6A蛋白表达明显被促进(P<0.01),与miR-378d mimic NC组比较,HG+miR378d mimic NC组KLF10、α-SMA与N-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.01),P-cadherin和nephrin蛋白表达明显降低(P<0.01),HG+miR-378d mimic组KLF10、α-SMA、N-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.01),P-cadherin、nephrin蛋白表达明显升高(P<0.01),与miR-378dinhibitor NC组比较,miR-378d inhibitor组KLF10、α-SMA、N-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.01),P-cadherin、nephrin蛋白表达降低(P<0.01),nephrin蛋白表达变化无统计学意义(P>0.05),SQYSF+miR-378d inhibitor组KLF10、α-SMA、N-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.01),P-cadherin、nephrin蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:缩泉益肾方可有效改善DKD小鼠的生理生化指标和肾脏病理改变,缓解小鼠肾脏损伤,其作用机制是通过miR-378d抑制KDM6A/KLF10信号轴表达,从而改善小鼠足细胞EMT和足细胞损伤。